BAB 6. REPLIKASI DNA DAN EKSPRESI GEN

Bagian genetis sel menentukan proses replikasi dan ekspresi informasi tingkat kesuburan sel. Informasi tingkat kesuburan sel semua makhluk hidup ditandai dalam DNA (deoxyribonucleic acid molecul(s)) sel. Informasi yang terimpan di dalam DNA menentukan tingkat metabolisme dan struktur suatu organisme. Sifat ‘helical’ ganda dari DNA makromolekul mempengaruhi replikasi sel. Penemuan DNA helix berganda oleh James Watson dan Francis Crick tahun 1953 membuat ilmu pengetahuan bidang biologi berevolusi. Penemuan struktur DNA ini mengungkapkan bahwa betapa banyaknya informasi yang disampaikan dari satu generasi ke generasi berikutnya.

Ekspresi informasi genetis melibatkan penggunaan informasi yang ditandai melalui DNA kepada sintesis protein secara langsung. DNA mengandung gen-gen regulator yang berfungsi mengontrol tingkat ekspresi gen. Dengan meregulasi dan mengkhususkan sintesis protein, makromolekul informatif genetis menjelaskan dan mengontrol kemampuan metabolisme mikroorganisme (Fig. 6-1). Susunan nukleotides dalam struktur DNA digunakan untuk menspesifikkan aturan asam amino dalam protein. Informasi yang terdapat dalam molekul DNA di dalam proses disebut dengan transkripsi (transcription).

(Transkripsi = DNA → RNA).

Pesan ditandai dalam molekul mRNA yang kemudian diterjemahkan dalam rentetan peristiwa asam amino yang terdiri dari protein.

(Simbolnya, RNA → protein).

Pengetahuan ini dari kejadian tingkat molekul terlibat dalam proses transmisi dan ekspresi informasi genetis telah merevolusi pemahaman kita terhadap ilmu genetika dan merupakan dasar dari biologi.

6.1. REPLIKASI DNA

Replikasi dari informasi turun temurun dari sebuah sel melibatkan proses sintesis molekul DNA yang baru, yang memiliki rentetan peristiwa nukleotida, sebuah proses yang membutuhkan ketepatan terbaik.

Replikasi = DNA → DNA

Genome yang terdapat di progeny harus mengandung informasi yang sesuai untuk membiarkan laju perkembangbiakan organisme. Karena perubahan – perubahan dalam rangkaian nukleotida bisa mengubah karateristik dari sebuah organisme secara langsung, proses replikasi DNA membutuhkan fidelitas yang terbaik. Proses replikasi DNA dibentuk untuk meyakinkan bahwa progeny menerima salinan akurat informasi genetis dari sel induk.

DNA (Deoxyribonucleic Acid).

DNA adalah makromolekul yang menyimpan informasi turun temurun dari sebuah sel. Ini disusun dari beberapa unit, disebut nukleotida, yang meterupai huruf ‘alfabet genetis’. Susunan nukleotidan mengkhususkan sifat informasi genetis sel dan mengandung mekanisme pengontrolan informasi genetis. Seperti hal di atas, DNA kadang-kadang disebut ‘molekul master’. Rentetan nukelotida melalui molekul DNA menandakan properti-properti potensial semua sel dengan menetukan rentetan asam amino dalam protein tertentu. Hal ini seperti dengan meyatakan bahwa pengaturan dan sejumlah angka-angka digunakan untuk menciptakan maknanya masing-masing. Kode genetis, didasarkan kepada ‘beberapa huruf’ (nukelotida) pada alfabetnya menyediakan dasar kimia yang penting untuk penandaan informasi genetis dan kemudian menciptakan perbedaan di antara makhluk hidup (organisme).



Deoxyribonucleotides

Makromolekul DNA dibuat atas beberapa unit yang disebut dengan deoxyribonucleotides. Deoxyribonucleotides ini seringkali ditujukan sebagai nucleotides, istilah generik yang juga menggambarkan bonucleotides di dalam RNA. Setiap deoxyribonucleotides mengandung nucleic acid (asam nucleic) base, gula deoxyribos, dan fosfat. Empat buah landasan asam nucleic yang berbeda dalam nucleotida DNA antara lain; adenine, guanine, cytosine, dan thymine.

Adenine (A) dan Guanine (G) adalah purines, yang merupakan molekul-molekul yang terdiri atas dua cincin fusi. Cytosine (C) dan Thymine (T) adalah pyrimidines, yang hanya memiliki satu cincin (Fig. 6-2).

Purines dan pyrimidines adalah molekul heterocyclic; cincin mereka mengandung dua jenis atom, bon dan nitrogen, tidak hanya sekedar karbon. Landasan asam nucleic disusun pada gula deoxyribose untuk membentuk deoxyribonucleosides, dan deoxyribonucleosis disatukan dalam kelompok fosfat dalam karbon 5’ dari gula untuk membaca huruf-huruf dari sebuah kata (dari kiri ke kanan pada bahasa Inggris), membaca rentetan nucleotida dalam susunan yang pas sangat penting dalam mengkonversi penyimpanan informasi genetis. Struktur DNA memberikan kelangsungan makromolekul.

Deoxyribonucleosides dalam DNA dihubungkan melalui 3’-5’ ikatan phosphodiester untuk membentuk polynucleotides (Fig. 6-3). Sebagai akibatnya, pada satu bagian akhir molekul asam nukleic, tidak ada ikatan phosphodiester ke karbon 3’ dari monosaccharide; dengna demikian ada yang bebas, grup hydroxyl pada posisi karbon-3’, dan ini disebut 3’-OH ujung bebas (free end).

Pada bagian akhir lain dari molekul, karbon-5’ tidak dilibatkan dalam pembentukan jalinan phosphodiester, dan terdapat grup ester prosphate bebas pada posis karbon-5’ sehingga ini disebut dengan 5’-P ujung bebas. Kenyataan bahwa bagian akhir dari DNA makromolekul berbeda merupakan hal yang sangat penting karena hal ini memberikan pengennalan langsung kepada tingkat biokimia pada rasa yang sama yang bisa kita kenali kiri dan kanan. Hal ini penting bagi DNA untuk menampilkan fungsi prinsipilnya dalam sistem biologis, yang menyimpan dan memindahkan informasi genetis sel.

Makromolekul DNA yang mengandung informasi genetis DNA dalam semua sel makhluk hidup mengandung dua rantai polynucleotide yang bekerja dalam petunjuk yang berlawanan. Konsekuensi dari sifat antiparalel ini dari molekul DNA yang berbeda informasi disimpan di setiap rantai. Hal ini kemudian bermaksud bahwa sebuah region yang diberikan pada informasi tersimpan, pasti ada beberapa mekanisme untuk menyusun bagian mana dari ranati tambahan bekerja dengan sistem tepat untuk mengekstraksi informasi tepat yang menandai fungsi tertentu. Seperti yang didiskusikan nanti, ada pengenalan lebih lanjut terhadap rentetan penandaan melalui molekul DNA yang menyusun rantai mana yang akan dibaca, ke mana akan mulai, dan ke mana akan berakhir.

Helix Ganda

Makromolekul DNA adalah sebuah helix ganda yang terdiri atas dua helaian polynucleotide utama disusun dengan ikatan hydrogen (Fig. 6-4). Sebuah ikatan hydrogen adalah jalinan lemah berdasarkan pemisahan asupan melalui molekul karena keelektronegatifan atom-atom spesifik dalam molekul tersebut. Tipe ikatan ini muncul ketika sebuah atom hidrogen diasup energi positif yang secara ‘covalent’ diikat ke sebuah atom berisi elektronegatif melalui sebuah molekul (oxigen atau nitrogen) secara simultan disusun ke sebuah ataom nitrogen atau oxigen yang berisi atom negatif dari molekul tersebut. Ikatan-ikatan hidrogen tersebut yang mengatur rantai-rantai secara bersamaan muncul diantara dasar-dasar asam nucleic pelengkap. Adenine biasanya berpasangan dengan thymine, dan guanine biasanya berpasangan dengan cytosine. Dua ikatan hydrogen terbentuk di antara pasangan-pasangan dasar adenine dan thymine. Tiga ikatan hidrogen membentuk di antara pasangan-pasangan dasar guanine dan cytosine. Hal ini bermaksud bahwa semakin banyak pasangan dasar guanine – cytosine dalan sebuah helix ganda DNA, semakin kuat dua helaian tersebut bersatu.
Sebagai tambahan dalam ikatan hidrigen, helix ganda DNA distabilkan oleh interaksi hydroponic. Nitrogen-landasan asam nucleic ditimbun hampir secara horyzontal sepanjang poros interior dari helix ganda dan grup hidroponik ini kemudian dijaga dari air. Berlawanan dengan gula deoxyribose hydrophilic-phosphate tulang belakang terdapat di luar poros dari helix ganda dan berinteraksi dengan air. Pengaturan ini membantu menjaga pengaturan helix ganda dari makromolekul DNA.

Helix ganda memiliki sebuah diameter sekitar 2 nm. Setiapnya melengkapi helix sepanjang 3,4 nm untuk panjang sehingga ada sekitar 10 nucleotide dalam setiap rantai per giliran. Sepanjang poros DNA helix terdapat alur-alur utama yang lebih besar, dan alur-alur kecil yang lebih sempit. Alur-alur ini, terutama bagian alur-alur utama, di mana pasangan-pasangan landasan lebih mudah terakses, lebih penting untuk interaksi protein – DNA. Bentuk yang paling umum disebut B-DNA (Fig.6-5). Ini merupakan bentuk kanan (bagian helix berotasi sesuai arah jarum jam menjauh dari titik amatan ke bagian bawah poros). Di bawah kondisi fisiologis berbeda, DNA mungkin menganggap bentuk-bentuk tangan kanan yang berbeda yang mempengaruhi kerekatan dari penyatuan di atas. Sejumlah landasan yang berbeda setiap giliran dari DNA muncul dalam bentuk ini, yang disusun atas A-, C-, D-, dan E-DNA.

A berposis sebelah kiri dengan bentuk helical DNA, disebut Z-DNA (lihat Fig. 6-5), juga telah diteliti untuk memunculkannya dalam bentuk susunan-susunan DNA di bawah kondisi seluler tertentu. Bentuk-bentuk berbeda ini muncul dihubungkan ke perbedaan-perbedaan dalam ekspresi gen tapi arti sebenarnya tidak terlalu dimengerti.

Dalam beberapa kawasan (susunan) DNA, rentetan nukleotides bersifat simetris tentang sebuah poros karena rentetan nukleotides yang sama muncul dalam arah yang berlawanan. Rentetan seperti itu disebut palindrome (dalam bahasa Mesir, ‘untuk menggerakkan kembali’) bermaksud bahwa rentetan berbagai karakter yang dibaca sama ketika dibaca dari kiri ke kanan atau kanan ke kiri. Rentetan palundromic disebut ‘inverted repeats’, karena mereka diulang dalam aturan yang disusun. Rentetan pengulangan terinversi memberi kelaluasam memberikan landasan berpasngan melalui heiaian yang sama. Denaturasi terlokalisasi dari helix ganda menuju pemisahan helaian, dan kawasan-kawasan dalam DNA yang mengandung pengulangan inversi bisa membentuk struktur-struktur hairpin ikatan-hidrogen yang dikenal dengan sebutan ‘cruciform loops’. Struktur-struktur ini mungkin menstabilisasikan lipatan DNA dan bertindak sebagai aturan-aturan terkendali untuk protein-protein yang memotong DNA. Bagaimanapun juga, hal ini tidaklah terlalu jelas apakah cruciform loops muncul di samping sel makhluk hidup atau sebuah manifestasi dari DNA terisolasi dalam tutup test. Penemuan pemasangan landasan dan pengikatan hidrogen sangat berpengaruh dalam pemahaman bagaimana DNA bisa direplikasi. Oleh karena ikatan hidrogen sangat lemah, dua helaian DNA bisa dipisahkan tanpa menganggu susunan utama nucleotida melalui setiap helaian individu. Kemudian setiap helaian menentukan kapasitasnya untuk berfungsi sebagai template untuk replikasi DNA. Pemasangan landasan dengan pengikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan landasan tambahan kemudian menetapkan proses pelurusan utama untuk formasi helaian-helaian baru DNA dengan rentetan tambahan melalui DNA helix yang stabil.

Struktur DNA dalam Bakterial, Archaeal, dan Kromosom Eukaryotik

DNA double helical diatur dalam semua sel menuju struktur-struktur yang secara genetik ditujukan sebagai kromosom. Kromosom mengandung paling banyak informasi genetis sebuah sel, meskipun sel bakterial dan arkaeal juga memiliki plasmids dan sel eukarytik memiliki beberapa episomes (element-element ekstrakromosal). Informasi genetis yang dikandung dalam kromosom dan plasmids atau episomes ditujukan sebagai genome sel (tingkat totalitas informasi genetis). Kebanyakan di sel bakteri, kromosom bakteri diatur sebagai sebuah gulungan sirkular tunggal.

Persamaannya, kromosom arkaeal adalah gulungan sirkular tunggal berdasarkan tipenya, ditiru oleh methanogens di kromosome arkaeal (methane-pembuat archaea) dan thermophiles ekstrim (archaea yang tumbuh paling baik di temperatur 80˚ C. Dalam sel eukaryotik terdapat kromosom multipel secara umum yang sifatnya linear bukan sirkular. Bagaimanapun, ada beberapa pengecualian di antara pengelompokan mikroorganisme. Beberapa bakteria, seperti streptomyces, memiliki kromosom-kromosom linear. Bakterium bernama Agrobacterium tumafaciens memiliki satu kromosom sirkular, satu kromosom linear dan beberapa plasmids. Hallophillic archaea (archaea yang tumbuh dalam konsentrasi garam yang tinggi) memiliki dua ‘plasmids sirkular raksasa’ sebagai tambahan terhadap kromosom archaeal sirkular.

Kromosom bakteri dan archaeal mengandung DNA paling banyak untuk menyesuaikan diri dengan mudah ke dalam sel. Hal yang sama, kromosom eukaryotik mengandung DNA dalam jumlah yang besar di dalam nucleus. Oleh karena itu, DNA harus dipadatkan sehingga bisa disesuaikan ke dalam sel atau nucleus. Hal ini diatur dengan supercoiling DNA menuju bentuk yang lebih dipadatkan. Kromosom sel eukaryotik dipadatkan menuju bentuk yang disebut kromatin. Penyempitan ini (DNA) menjadi kromatin melibatkan protein-protein tertentu. Kromosom eukaryotik mengandung sejumlah protein, sekitar dua kali lebih banyak sebanyak asam deoxyribonucleic. Protein yang terlibat dalam pemebentukan kromatin dalam sel-sel eukarytik merupakan protein-protein dasar yang disebut histones. Histones-histones ini memfasilitasi proses supercoiling DNA, yang menentukan molekul. Beberapa bakteria dan archaea memiliki protein-protein dasar- protein-protein seperti histones- yang membentuk perbedaan-perbedaan dengan DNA. Bangaimanapun juga, interaksi dari protein-protein histones dan DNA tidak mengarah kepada pembentukan kromatin dalam sel-sel bakteria dan archaeal.

Selama eukaryotik DNA dipersempit menjadi kromatin, berbagai gen-gen tidak bisa diekspresikan karena mereka tidak bisa diakses. Namun demikian, eukaryotik genome begitu besar bahwa terdapat beberapa gen yang mudah terakses yang bisa diekspresikan untuk mendukung fungsi-fungsi seluler. Genome sel manusia, sebagai contoh, terdiri dari 46 kromosom yang mengandung sekitar 5.000 Mbp (pasangan landasan berukuran Mega). Ukuran ini sekitar ribuan kali lebih besar daripada yang ada di dalam kromosom-kromosom bakterial. Kromosom bakteri E.coli, contohnya, sekita 4,5 Mbp. Archaeal genomes lebih kecil lagi. Kromosom archaeal dari Methanococcus jannaschii hanya sekitar 1.6 Mbp. Sebagai hasil dari ukuran genomes yang lebih kecil, kebanyakan gen-gen bakteri dan archaeal harus diekpresikan dan tidak bisa diatur dalam bentuk sequestered melalui kromatin. Bahkan spesies Bacillus, yang mengalami pembedaan selular, hanya sekitar 10 % dari genome yang diabadikan untuk mengembangkan gen-gen yang telah diregulasi. Pertentangannya, kebanyakan DNA dalam sel eukaryotik tidak diperlukan kepada berbagai titik dan bisa diatur dalam sebuah bentuk penyempitan pasif melalui khromatin.

Proses supercoiling DNA dalam sel-sel Eukaryotik

Penyempitan atau supercoiling DNA dalam sel-sel eukaryotik distabilkan melalui satu grup histones (Fig. 6-8) dan juga oleh protein-protein non histones. Histones melipat DNA melalui nucleus sel eukaryotik menuju nucleosomes, yang kemudian direkatkan untuk membentuk khromatin. Ada lima tipe molekul histones dalam sel-sel eukaryotik (H1, H2A, , H2B, H3, dan H4) yang berkontribusi pada supercoiling DNA dan perekatan untuk membentuk nucleosomes. Histones berinteraksi untuk membentuk sebuah octomer (8 subunits) yang terdiri atas dua molekul masing-masingnya H2A, H2B, H3, dan H4. Octomer ini merupakan dasar terhadap titik sekitar helaian DNA, sama halnya dengan benang-benang yang dijalin di tempat benang.

Proses Supercoiling DNA dalam sel-sel Bakterial

Bakterial DNA di-supercoilkan atau diikat dengan kuat sehingga ini membentuk simpul-simpul dan pilinan di sekitarnya seperti pilihan kabel telepon. DNA dalam bentuk sirkular sederhana dinyatakan untuk disederhanakan (Fig. 6-9). Ketika DNA diistirahatkan memiliki satu helaian yang rusak, terpilin pada arah giliran helix, dan kemudian dilepaskan, DNA menjadi terikat kuat atau tersupercoilkan dengan positif. Perubahannya, ketika DNA istirahat memiliki satu helaian yang rusak, terpilin dalam arah berlawanan saat giliran helix berbelok, dan kemudian dilepaskan, DNA menjadi kurang atau tersupercoilkan secara negatif. DNA pada keberadaan normalnya ditemukan dalam sel-sel bakteri dalam sebuah ketepatan supercoil negatif dan pengikatan DNA (seperti histones), protein-protein berkemunikan berperan dalam supercoiling ini. Protein-protein dengan kemampuan pengikatan DNA dan properti-properti seperti histones (asupan positif dan preferensi titik ikatan berdasarkan kepada DNA daripada rentetan nucleotide) telah ditemukan dalam sel-sel bakteri. Bagaimanapun juga, hal ini tidak diketahui jika protein-protein ini menggulung DNA dalam kondisi analogous terhadap aksi histones dalam sel-sel eukaryotik. Enam tipe berbeda dari DNA histone mengikat protein telah diisolasi dari E.coli. Keluarga HU dari protein-protein menyerupai histone bakterial telah ditunjuk untuk membelok, membalut, dan memandatkan DNA ‘in vitro’ dan mungkin juga telah melakukan hal yang sama pada makhluk hidup. Hal ini diperkirakan bahwa protein menyerupai histone dalam sel-sel bakteri menuju ke pembentukan gulungan dengan struktur supercoil dan ini mempermudah pengangkutan DNA ke dalam sel-sel bakteri.

Proses supercoiling DNA dalam Sel-Sel Archaeal

Pengikatan protein-protein DNA berkemungkinan berfungsi sebagai peran penting dalam meningkatkan integritas struktur dari genomes kromosom archaeal, berkemungkinan untuk kehidupan archaea di temperatur tingkat tinggi. Dalam archaea terdapat beberapa grup protein menyerupai histone, termasuk protein-protein HMf, protein-protein Hta, serta protein-protein MC1. Protein-protein archaeal HMf ssama dengan histones di sel-sel eukaryotik. Mereka muncul untuk berbagi nenek moyang yang umum dengan eukaryotik histones H2A, H2B, H3, dan H4. Protein-protein HMf menggulung DNA sehingga ini terikat melalui sel archaeal.
Hta (histone dari Thermoplasma acidophilum) berkaitan dengan protein-protein HU, di mana ini merupakan protein-protein menyerupai histones dari sel-sel bakteri. Protein-protein ini menggulung dan mengikat DNA dalam toroidal negatif (ukiran donat) supercoils. Hta membentuk tetramers yang mengikat DNA menjadi lebih kecil (5,5 nm) partikel-pertikel menyerupai manik-manik. MC1 adalah sebuah protein dengan kromosom dari methanogens. Ini mengikat DNA dan mempererat ikatan.

Keberagaman DNA-histone (nucleohistone) merupakan struktur berupa manik-manik (10-11 nm) yang mudah dilihat dalam ukuran elektron mikrograph dan disebut nukleosome (Fig. 6-8 dan 3-31, B). Setiap nucleosome mengandung dua heterodimers (H3 + H4) didampingi oleh heterodimers (H2A + H2B). Sekitar pusat protein ini dibalutkan 146 bp DNA dalam 1,75 toroidal negatif (ukuran donat) supercoils. Histone H1 membentuk keberagaman dengan DNA secara langsung sama untuk setiap nucleosome.

Ketika kromatin diekstraksikan di bawah kondisi berkonsentarsi garam rendah menuju nucleosomes ketika dilihat melalui mikrosop elektron. Di bawah kondisi normal dalam sel, kromatin berkemungkinan diikatkan ke helix lapisan ke dua sekitar enam nucleosomes per tikungan. Struktur ini disebut solenoid (Fig. 3-31, A). Hal ini sifatnya mungkin, bahwa melalui kromosom, solenoids kemudian dikenali menjadi supercoil yang lebih besar.

Sebagai tambahan dari peran mereka dalam supercoiling DNA, histones dari pengikatan ragi ke kromosom telah ditunjuki uktuk memiliki fungsi regulator untuk gen-gen yang terlibat dalam pemasangan. Rentetan asam amino di bagian akhir terminal amino dari protein-protein histone H3 dan H4 merekat ke rentetan DNA yang mengandung silent mating loc (SMLs) dan telemores histone-histone tersebut membutuhkan protein-protein tambahan, SIR3 dan SIR4. Histones dan protein SIR membentuk sebuah kekompleksitasan di mana gen-gen pasif terlibat dalam pemasangan tipe a dan tipe α sel-sel ragi. Pengikatan histones dengan protein-protein tertentu ke bagian-bagian lainnya dari kromosom ragi juga memiliki fungsi regulator.

Sifat Semikonserfatif dari Replikasi DNA

Replikasi dari molekul ganda helical DNA bersifat semokonserfatif (prosesnya), karena ketika DNA helaian-ganda direplikasikan kepada DNA helical ganda yang berdekatan mengandung satu helaian utuh dari DNA helical ganda induk dan satu helaian tambahan sintesis terbaru. (Fig. 6-11). Ini didemonstrasikan untuk sel-sel bakterial dalam eksperimen klasik Meselson dan Stahl tahun 1958 (lihat kotak 6-2). Replikasi DNA semikonserfatif telah ditunjukkan untuk muncul dalam sel-sel archaeal dan eukaryotik.

Secara inisial, helix ganda pasti tidak terlihat dan terpisah menjadi helaian tunggal sehingga setiap lapisan digunakan sebagai ‘template’ untuk rakitan dari helaian tambahan. Area DNA helix berupa pemisahan helaian, dan sintesis DNA dilokalisasikan dan ditujukan sebagai ‘replication fork’ (Fig. 6-12) di mana landasan nucleotida bebas tersusun secara berlawanan pada pasangan dasar mereka. Hal ini terlihat pada molekul DNA induk, di mana A berlawanan dengan T dan G berlawanan dengan C. Di ‘replication fork’ terdapat empat helaian DNA, dua dikonserfasikan dan dua lainnya disintesiskan terbaru. Sekali replikasi diinisialkan, proses penyalinan DNA induk ke DNA putri tidak bisa diinterupsi lagi.

DNA polymerase, yaitu enzim-enzim yang mensintesis DNA, bisa menambah nucleotides ke 3’-OH bebas ke 5’-P akhir. Oleh karena itu, sintesis dari helaian tambahan membutuhkan sintesis DNA di atas yang diproses dalam arah yang berbeda sementara helix ganda secara berkesinambungan mereplikasi hanya dalam satu arah.

Perhatikan bahwa salah satu helaian DNA secara berkelanjutan disintesiskan karena ini memanjang ke arah yang sama sebagai cabang replikasi tingkat tinggi (Fig. 6-13). Helaian ini merupakan lanjutan atau titik awal dar helaian DNA.

Helaian lain dari DNA, bagaimanapun juga harus disintesiskan secara berkelanjutan dalam segmen-segmen. Penandaan sintesis dari pemberhentian helaian DNA mulai setelah beberapa helix ganda tidak diputar dan oleh karena itu tertinggal di belakang sintesis helaian lanjutan. Ini ditujukan sebagai ‘lagging strand’ (peninggalan helaian). Oleh karena helaian awal direplikasi secara berkelanjutan dan helaian peninggal tidak direplikasi secara berkelanjutan, replikasi DNA ditujukan sebagai ‘semidiscontinuous’. Helaian peninggal disintesiskan secara inisial sebagai lapisan pendek DNA (sekitar 2.000 nukleotides panjang dalam sel-sel bakterial dan sekitar 200 panjang nukelotides dalam sel-sel eukaryotik), dikenal sebagai ‘okazaki fragments’ (Fig. 6-13). Fragmen-fragmen okazaki ini kemudian digabungkan oleh aksi ‘DNA ligase’. Kemudian, melalui aksi yang dikombinasikan antara DNA polymerases dan DNA ligase, kedua helaian tambahan DNA bisa disintesiskan selama replikasi DNA.

Hal ini lebih efisien terhadap sel untuk mereplikasi sepanjang bagian-bagian DNA dengan enzim-enzim yang membentuk keanekaragaman yang tinggal bersama sepanjang helix. DNA polymerase ini dan protein-protein yang diikaatnya, ditujukan sebagai ‘replisome’ bergerak sepanjang template DNA, menambah nukleotida tanpa menyatukan dan menggabungkan ulang setiap langkah. Kenyataan bahwa enzim terlibat dalam replikasi DNA tinggal bersama tidak sama dengan reaksi enzymatik, di mana enzim-enzim secara tidak langsung tidak bergabung setelah katalis. Membuat enzim-enzim bertindak sebagai replisome kompleks membuat prosesnya lebih efisien, dan lebih lanjut, lebih berkesinambungan. Pembentukan replisome kompleks dan prosesnya memberikan kesempatan kepada proses replikasi DNA yang lebih cepat – di mana deoxyribonucleotides ditambahkan pada tingkat sekitar 1.000 deoxyribonucleotides per detik.

Replikasi DNA dalam Sel-Sel Bakterial

Replikasi DNA semikonserfatif dari kromosome bakterial mulai dari area replikasi (oriC), area DNA di mana terdapat penandaan protein-protein spesifik ditambahkan (Fig. 6-14). Asal replikasi dipasang ke permukaan paling dalam dari membran cytoplasmic. oriC dan E.coli terdiri atas 245 bp dan mengandung tiga 13-bp rentetan pengulangan dan empat 9-bp rentetan pengulangan di mana DnA protein diikat secara inisialnya. DNA polymerase pindah dua kali arah dari asalnya ke titik akhir replikasi DNA sehingga terdapat dua replikasi cabang bergerak ke arah yang berbeda sepanjang helix ganda dari titik asal replikasi dalam arah yang berbeda dan sekitar kromosom sirkular. Cabang-cabang replikasi dua arah bergerak dalam kecepatan yang sama di bagian pemberhentian. Dalam E.coli dan kemungkinan dalam bakteria lainnya, kekurangan replikasi DNA tidak terlalu berlawanan dengan asalnya di kromosom bakterial sirkular. Terminus terdiri atas empat ‘ter’ rentetan; terA dan terD replikasi titik akhir dari salah satu helaian replikasi DNA dan terB dan terC titik akhir dari replikasi DNA lainnya. Semua ‘ter’ di atas mengandung rentetan konsensus sebesar 23-bp yang dikenali dengan protein Tus, yang menjaga cabang replikasi dari proses kelanjutan.

Sebagai hasil dari replikasi sirkular molekul DNA, sebuah struktur theta dibentuk (seperti lambang θ) dengan gulungan DNA yang muncul dalam proyeksi planar (Fig. 6-15). Sifat sirkular kromosom bakteri dan kenyataan bahwa selama sintesis, gulungan sirkular baru DNA tumbuh ke luar dari DNA induk didemonstrasikan oleh John Cairns menggunakan autoradiography. Dalam metode ini, bakteria dikembangkan dalam kumpulan radioaktif, contoh, tritiated (³H) thymidine, yang digabungkan ke dalam DNA. Sel-sel bakterial melepaskan molekul-molekul DNA radioaktif. Emulsi fotografis ditempatkan sepanjang kromosom bakteri dan diinkubasi dalam gelap. Ketika materi radioaktif membusuk, ini akan melepaskan partikel-partikel yang menabrak film dan meledakkannya. Area radioaktifitas dideteksi dengan autobiography menjelaskan sifat sirkularnya (autodiogram menunjukkan gulungan sirkular bentuk linear diteliti untuk kromosom dalam sel-sel eukaryotik). Pengamatan gulungan juga dengan jelas mendemonstrasikan bahwa terdapat replikasi DNA dalam sel-sel bakteri.

Replikasi DNA dalam Sel-Sel Archaeal

Hal ini tidak dapat diketahui apakah replikasi kromosome archaeal mulai dari asal multipel seperti di sel-sel eukaryotik. Pemebrian sifat sirkular dari kromosom archaeal (menyerupai bakterial) dan kenyataan bahwa arcaheal genome lebih kecil sehingga ini bisa direplikasi secara cepat, seseorang bisa memprediksi bahwa hanya ada asal tunggal replikasi. Bagaimanapun, kebanyakan protein-protein terlibat dalam replikasi archaeal DNA lebih banyak berhubungan dengan protein-protein eukaryotik daripada ke protein-protein bakterial. Hal ini menyarankan bahwa replikasi dari kromosome archaeal mungkin mengikuti motif replikasi kromosomal eukaryotik dan memiliki titik-titik asal multipel.

Replikasi DNA dalam Sel-Sel Eukaryotik

Replikasi eukaryotik DNA mulai dari titik asal multipel dengan setiap kromosome dan memproses dengan dua arah. Tingkat sintesis DNA sepanjang cabang replikasi mungkin lebih lambat di eukaryotik daripada dalam sel-sel bakterial. Replikasi DNA dalam bakteria memproses dalam tingkat uniform, tapi tingkat sintesis DNA dalam sel eukaryotik bisa beragam. Meskipun perbedaan potensial, ini berbeda pada tingkat sintesis DNA melalui area tertentu, tingkat keseluruhan replikasi DNA lebih tinggi dalam sel-sel eukaryotik daripada dalam sel-sel bakterial. Hal ini terjadi karena DNA dari eukaryotes memiliki ‘replicons’ multipel (lapisan dari sebuah makromolekul DNA memiliki asal mereka sendiri dan terkecil) dibandingkan ke replican tunggal dari kromosom bakterialnya. Kemudian, meskipun terdapat DNA lebih banyak dalam kromosom eukaryotik daripada dalam kromosom bakterial, eukaryotik genome bisa direplikasi lebih cepat (25 sampai 30 menit dalam ragi) daripada bakterial genome (40 menit dalam E.coli). Hal ini terjadi karena point inisiasi multipel untuk sintesis DNA yang mempengaruhi hasil dalam replikasi spontanous dari area berbeda dari kromosome. Perbedaan antara area sintesis DNA tunggal dan multipel adalah perbedaan fundamental antara sel-sel bakterial dan eukaryotik.

Keperluan untuk mengkoordinasikan replikasi dari jutaan pasangan landasan mulai dari ratusan ke ribuan titik dalam kromosome multipel membuat replikasi DNA dalam sel-sel eukaryotik lebih jauh kompleksitasannya daripada dalam sel-sel bakterial atau archaeal. Dalam sel-sel eukariotik replikasi dari beberapa rentetan DNA diinisiasikan lebih awal dalam fase sintesis (S) pertumbuhan sementara rentetan lainnya direplikasikan di tahap selanjutnya dalam sikuls sel. Bukti menunjukkan bahwa mekanisme dasar dalam mengkoordinasi keaslian replikasi DNA bersifat identikal dalam semua sel-sel eukaryotik.

Koordinasi penting untuk replikasi DNA dalam sel-sel eukaryotik, diatur lebih utama dari penelitian dengan ragi Saccharomyces cerevisiae, berakhir dalam interaksi antara protein-protein spesifik dan rentetan nukleotide DNA pendek khusus yang didistribusikan melalui kromosomal DNA. DNA dalam sel-sel eukaryotik memiliki ARCs (autonomously replicating sequence) yang berperan sebagai asal muasal replikasi dan mereka saling berlawanan dari asal bakterial (ori). ARCs terdiri atas 11 pasangan landasan rentetan tambah dua atau tiga rentetan nucleotida pendek tambahan dengan 100 hingga 200 pasangan landasan sepanjang area DNA. Grup utama dari enam protein, secara kolektif dikenal dikenal sebagai ORC (Origin Recognition Complex), mengikat asal muasal replikasi, menandai replikasi DNA dengan tepat pada saat waktu yang sesuai melalui siklus sel.

Langkah utama dalam penandaan replikasi DNA adalah pembuatan kompleks pra-replikasi yang mengandung ORC dan beberapa protein lainnya, termasuk Cdc6, Cdc7, protein MCM dan Dbf4. Dengan membangun pra-replikasi kompleks ini, yang hanya muncul selama fase S pertumbuhan, melibatkan satu seri cyclin mandiri kinase. Cyclins adalah protein-protein yang meregulasi kejadian-kejadian selama porsi mitotic dari siklus sel dan kinases mandiri cyclin membutuhkan cyclins ini agar dapat berfungsi. Sebagai contoh, Cdc7 adalah cyclin dependent kinase yang membutuhkan protein Dbf4 cyclin agar berfungsi.

ORC dan protein-protein yang berhubungan dengannya terlihat telah disusun selama evolusi sel eukaryotik. Mereka berfungsi untuk menghubungkan replikasi DNA dalam sel eoukaryotik untuk menetapkan waktu selama siklus sel. Protein-protein MCM yang terlibat dalam pembentukan pra-replikasi kompleks dibutuhkan untuk menandai replikasi DNA yang juga terlibat dalam fenomena di atas di sebut juga ‘pelisensian’ (licensing). Pelisensian merujuk kepada waktu yang dimiliki selama replikasi DNA yang mana bisa muncul dalam sel-sel eukaryotik. Ini muncul karena replikasi eukaryotik DNA membutuhkan beberapa faktor yang bisa memperbesar akses ke kromosom hanya dengan menggunakan mitosis ketika membran nuklir telah diturunkan. Sekali replikasi DNA berperan dalam faktor pelisensian di non-aktifkan. Replikasi DNA tidak muncul lagi setelah reproduksi sel muncul dan siklus sel menuju ke fase S.

Dalam ragi Schizosaccharomyces pombe, protein-protein yang meregulasi replikasi DNA. Cyclin dependent kinase Cdc2 dan pasangan cyclin-nya telah diperlihatkan untuk menandai mitosis yang penting untuk reproduksi sel. Secara langsung setelah penandaan mitosis cyclin dihancurkan dan cyclin dependent kinase menjadi pasif. Cdc2 aktif menjaga replikasi dari proses inisiasi ulang ke dua kali, yang menjelaskan bagaimana terdapat hanya satu salinan setiap rentetan DNA dibuat selama replikasi DNA. Destruksi cyclin selama proses mitosis memindahkan faktor penghambat replikasi DNA. Memiliki enzim yang sama mengaktifkan replikasi DNAdan menghambat informasi dari pra-replikasi kompleks adalah mekanisme paling efisien dalam mengkoordinasikan replikasi DNA ke siklus sel dan untuk memastikan bahwa hanya ada satu salinan DNA dibuat pada setiap siklus replikasi.

Protein-protein yang terlibat dalam Replikasi DNA

Replikasi makromolekul DNA melibatkan satu seri kompleks reaksi enzimatik terkoordinasi (Fig. 6-16). Enzim-enzim ini pertama belum mempolakan dan mengikat lapisan DNA sehingga cabang replikasi ditetapkan. Kemudian, mengikuti jalinan nucleotides berlawanan dengan pasangan landasan mereka dalam template DNA, enzim-enzim lainnya bergabung dengan nucleotides menjadi helaian DNA tersintesis terbaru.

TOPOISOMERASES

Semenjak DNA helix disupercoilkan secara negatif, helaian-helaian masih harus digulung, atau ‘dibebaskan’ sebelum direplikasikan; tahap ini dicapai dengan topoisomerases. DNA topoisomerases mengubah sejumlah angka jalinan topologis ke dua helaian dari helix ganda dengan memperkenalkan pemecahan transient dalam tulang punggung phosphodiester dari DNA dan helaian pengkatalis DNA melewati pemecahan-pemecahan di atas. Dengan melakukan aksi demikian, mereka tidak hanya bisa santai tapi juga menggulung DNA.

DNA topoisomerases adalah enzim-enzim yang dikelompokkan ke dalam dua kategori (tipe I dan tipe II) didasarkan kepada mekanisme aksi mereka (Fig. 6-17). Tipe topoisomerases I memecahkan jalinan phosphodiester dari salah satu helaian DNA dan melewati helaian melalui yang lain, yang berakhir di area non-penggulungan. Hal yang mengejutkan, tidak ada energi yang dibutuhkan untuk memecah ikatan, dan enzim topoisomerases tipe I menggunakan energi ikatan kuat helaian DNA untuk berfungsi. Tipe topoisomerases II memperlihatkan supercoiling negatif menjadi DNA bebas dan karena itu penting setelah menukar DNA menjadi supercoil paling negatif, tingkat paling sempit.

Bakterial Topoisomerases

Beberapa tipe I dan tipe II DNA Topoisomerases bisa bekerja sama dalam sel-sel bakteri. Dalam E.coli terdapat dua tipe DNA topoisomerases tipe I (protein ω dan Topo III) dan dua tipe DNA topoisomerases (DNA gyrase dan Topo IV). DNA gyrase adalah salah satunya DNA topoisomerases dalam bakterial bisa bebas secara positif dan secara negatif menggulung DNA (Fig. 6-18). Dalam sel-sel bakteri, tipe I topoisomerases hanya mengikat gulungan DNA secara negatif menjadi DNA bebas. Hal ini berlawanan dengan sel-sel eukaryotik di mana tipe I topoisomerases bisa bebas secara negatif atau positif menggulung DNA.

Sehubungan dengan tipe II topoisomerases, hanya enzim-enzim bakteri memperngaruhi aktifitas gyrase (ATP – pemolaan mandiri DNA). DNA gyrase dari E.coli adalah tipe II topoisomerase yang mengandung empat subunit protein; dua subunit A dan dua subunit B. Subunit A ditandai untuk gen gyrA, yang bertanggungjawab untuk fungsi enzim dan dihalangi oleh antibiotik asam nalidixic dan ciprofloxacin. Hydrolyzes kedua helaian DNA, melewati helaian sepanjang bagian lain dari helix ganda dan kemudia menghubungkan ke goresan. Ebergi, dicapai dari ATP, dibutuhkan untuk menoreh helaian DNA (Fig. 6-17). Aktifitas ini (ATPase) dikandung dalam subunit B, yang dihalangi oleh antibiotik coumercyn dan novobiocyn. Subunit B ditandai untuk gen gyrB.

Archaeal Topoisomerases

Beberapa tipe I dan tipe II topoisomerases dalam sel-sel archaeal sifatnya sama dengan sel bakterial dan sel eukaryotik. Archaeal juga mengandung topoisomerase disebut ‘reverse gyrase’. Reverse gyrase adalah tipe I DNA topoisomerase yang akan mengikat 5’-P ujung DNA dalam helaian tunggal. Enzim ini memperkenalkan penggulungan positif menjadi DNA bebas melalui mekanisme ATP – mandiri. Aktifitas reverse gyrase telah dideteksi dalam bakteria hermophillic dan archaea tapi luar dari mesophillic dan lebih umum lagi dari thermophillic archaea. Fungsi reverse gyrase adalah untuk melindungi DNA dari pencarian (pemisahan helaian) pada temperatur tingkat tinggi di mana sel bisa hidup. Pengenalan terhadap penggulungan positif menuju DNA termophilles ekstrim mungkin menjadi faktor penyeimbangnya.


Eukaryotik Topoisomerases

Dalam sel ragi eukaryotik terdapat dua tipe DNA topoisomerases dan satu tipe II DNA topoisomerases. Salah satu bentuk tipe I topoisomerases bisa dihubungkan ke akhir 3’-OH dari DNA pada pemisahan helaian tunggal. Di mana semua genome bakterial digulung oleh DNA gyrase secara negatif, DNA nucleosome-bebas dalam sel-sel eukaryotik diatur secara umum dalam keadaan santai oleh tindakan tipe I dan tipe II DNA topoisomerases 3’-OH.

HELICASES

Selama replikasi DNA dalam bakterial, archaeal, dan sel-sel eukaryotik, helix ganda harus terpisah menjadi area-area helaian tunggal sebelum bisa digunakan sebagai template. DNA helicases dan protein DNA secara bersamaan. Reaksi ini membutuhkan energi dari ATP.

PROTEIN PENGIKAT HELAIAN-TUNGGAL

Sekali helaian tunggal dipisahkan, mereka dijaga dari pengasosiasian oleh SSBs (single-stranded binding proteins) yang menyangkut ke area helaian-tunggal DNA dan menstabilisasikan mereka (Fig. 6-16). SSBs dalam E.coli membentuk tetramers, terutama pada konsentrasi garam rendah. Dengan mengikat area-helaian tunggal di DNA, SSBs mempertahankana helaian-helaian ini dari pengolahan untuk membentuk helix ganda ikatan – hydrogen.

DNA POLYMERASES

Helaian-helaian tersintesis paling baru dari DNA ditetapkan dengan mengubungkannya dengan landasan-landasan nucleotide, dengan ikatan phosphodiester oleh aksi DNA polymerases. Sel-sel seringkali memiliki beberapa DNA polymerases yang berbeda, terkadang memiliki fungsi yang berbeda. Aksi DNA poymerases berakhir dalam rantai nucleotide dari molekul DNA yang telah disintesiskan dan bisa dihubungkan dengan ‘motion’ yang berkelanjutan (Fig. 6-16). DNA polymerases memiliki beberapa bagian yang menarik.

DNA polymerases yang secara spesifik terlibat dalam pemanjangan rantai pada cabang replikasi disebut ‘DNA replicases’ (Replikasi DNA adalah DNA polymerases spesifik yang terlibat dalam replikasi DNA untuk reproduksi seluler). Mereka memiliki struktur multisubunit dan bisa menampilkan replikasi DNA dalam tata berkelanjutan dalam replikasi DNA.

DNA polymerases dalam sel-sel bakterial

Beberapa DNA polymerases mandiri telah diisolasikan dari sel-sel bakteri, setiapnya berfungsi dengan tujuan berbeda-beda selama sintesis DNA. Dalam E.coli dan Bacillus subtilis, tiga DNA polymerases yang berbeda telah ditemukan: DNA polymerases I atau PolI, DNA polymerase II atau PolII, dan DNA polymerase III atau PolIII. DNA polymerase I dan II memiliki polypeptide tunggal, di mana DNA polymerase III disusun paling kurang tiga polypepetides untuk aktifitas fungsional dan sebanyak empat enzim tambahan lainnya (polypeptide) – Fig. 6-19.

Inisialnya, ketika PolI ditemukan oleh Arthus Kernberg tahun 1958 dianggap sebagai pertanggungjawaban enzim atasreplikasi DNA dalam sel. Namun, di tahun 1969, DeLucia dan Chaims mengisolasi seekor ‘mutant’ dari E.coli yang tidak memiliki aktifitas PolI dan kemudian mereplikasi DNA-nya. Investigasi selanjutnya membawa kepada penemuam PolII dan PolIII dalam E.coli dan bakteria lainnya. Dalam sel-sel bakterial, hanya DNA polymerase III bertindak sebagai pereplikat DNA.

DNA polymerases dalam sel-sel archaeal

Meskipun sel-sel mungkin memiliki beber pa DNA polymerases, hanya satu pereplikat DNA telah terdeteksi, sejauh ini kebanyakan dalam sel-sel archaeal tapi penelitian masih dilanjutkan dan pereplikat tambahan mungkin ditemukan. Dua DNA polymerases telah dilaporkan dalam ‘sulfolobus’; satu atau keduanya merupakan pereplikat. Replikase (tiruan) archaeal DNA muncul kemungkinan berhubungan dengan sel-sel eukaryotik. Baik sel eukaryotik dan archaeal terhadap tiruan DNA-nya sensitif ke amhidicolin di mana tiruan DNA sel bakteria bukan.

DNA Polymerases dalam sel-sel Eukaryotik

Lima tipe DNA polymerases antara lain α, β, γ, δ, dan Є , telah diidentifikasi dalam sel-sel eukaryotik. Bagian ini berbeda dari DNA polymerases I, II dan sel-sel bakteria III. α, δ, dan Є pada DNA polymerases berfungsi dalam replikasi DNA melalui nucleus. DNA polymerases γ berfungsi dalam replikasi mitochondrial DNA, dan bentuk β muncul dilibatkan dalam pemasangan DNA.

Pengoreksian percobaan melalui DNA polymerases.

Sebagai tambahan dalam aktifitas polymerasi (sintesis), bakterial dan DNA polymerases archaeal juga mengeluarkan aktifitas exonuclease, yang merupakan kemampuan untuk mendegradasi atau men-depolymerasi-kan rantai asam nucleic. Aktifitas exonuclease, bagaimanapun, tidak diasosiasikan dengan DNA polymerases dari organisme eukaryotik. Semua bakterial polymerase (PolI, PolII, dan PolIII) dan DNA polymerase archaeal bisa memindahkan landasan dari bagian akhir 3’-OH. Hanya PolI dan PolIII dan beberapa archaeal DNA polymerases memiliki aktifitas exonuclease dari akhir 5’-P.

Aktifitas exonuclease bakterial dan archaeal DNA polymerases memberikan kesempatan kepada mereka untuk memperbaiki kesalahan-kesalahan dalam molekul DNA. Jika landasan nukleotida yang tidak sesuai dimasukkan selama sintesis DNA, DNA polymerase bisa membalikkan arah, memindahkan landasan nukleotide dari bagian akhir molekul DNA, dan kemudian memperbaharui aktifitas polymerasinya. Pemberian potensial untuk mutasi dari pemasukan nucleotida yang tidak tepat, aktifitas ini sangat kritis. Landasan yang tidak sesuai dikenali karena pemasukan yang tidak pas menyebabkan pemasangan landasan dengan tidak stabil. Aktifitas exonuclease 3’-5’ dari DNA polymerases ditujukan sebagai ‘proofreading’ (pengoreksian). Tindakan ini membiarkan sel untuk memperbaiki kesalahan-kesalahan dalam pemasangan landasan yang muncul selama sintesis DNA karena penambahan nucleotides yang tidak tepat. Mekanisme ini menjelaskan, sebagian, bagaimana replikasi DNA telah mencapai mencapai kesetiaan tertentu. Dengan mengatur nucleotide yang ‘salah’, kemampuan pengoreksian DNA polymerases merendahkan frekuensi mutasi spontan, atau peubahan, dalam rentetan DNA yang berkemungkinan muncul selama replikasi. Hal ini meyakini bahwa informasi salinan dari molekul-molekul kesuburan bersifat benar.

Hal yang menarik adalah bahwa DNA polymerases yang telah diisolasi dari beberapa archaea memiliki kemampuan perbaikan yang tinggi. DNA polymerasi dari thermophillic archaeans, spesies thermococcus, memiliki keterikatan tinggi terhadap replikasi pada temperatur tinggi. Bagain ini telah diaplikasikan secara bermanfaat dalam teknik genetik di dalam salinan pasti dari rentetan DNA dibutuhkan.

Formasi Primer dan Pemindahan Primer

Semua DNA polymerases menambah deoxyribonucleotides hanya 3’-OH akhir bebas dari sebuah polymer asam nucleic bergerak (Fig.6-16). Untuk sintesis DNA untuk diinidiasikan, polymerases membutuhkan molekul mRNA pendek dengan 3’-OH bebas akhir disebut primer. RNA primer disintesiskan oleh RNA polymerase atau enzim lainnya, DnaG protein. RNA polymerase atau DnaG protein, kadang-kadang disebut ‘primase’, membuat sebuah RNA primer berlandaskan panjang sekitar 3 ke 5. Setelah primer telah disintesiskan, helaian disterilkan oleh DNA polymerase. Beberapa bakteria juga memiliki ribonuclease, Rnase H, yang bisa mengenali hybrida DNA-RNA dan memindahkan ribonucleotides utama dalam sel-sel bakteri adalah 5’ → 3’ aktifitas exonuclease dari DNA polymerases.

Ketika nucleotides telah dipindahkan dari satu helaian DNA, baik melalui DNA polymerase maupun dari aktifitas ribonuclease, hasilnya adalah ‘gap’ – area helix ganda di mana tidak ada landasan – landasan nukleotide tambahan berlawanan dengan salah satu helaian (Fig. 6-20, A). Gaps di dalam DNA diisi dengan aksi DNA polymerase I.

Kemudian PolI memainkan peran yang besar dalam replikasi DNA, terutama dalam pemindahan primer dan pengisian gap. Hal ini juga penting dalam memasang ulang DNA yang rusak oleh zat kimia atau radiasi. Ada beberapa cara bahwa bakteria bisa mengenali dan mengolah bagian-bagian yang rusak dari DNA. Mekanisme ini berujung kepada pembentukan gap setelah pemotongan deoxyribonucleotides yang diganti, yang membutuhkan bahwa gap diperbaiki oleh DNA polymerase I.

DNA LIGASE

Aktifitas polymerisasi dari DNA polymerases meuju untuk ‘nicks’ dalam helaian tersintesis terbaru, yaitu, pendamping 3’-OH dan bagian akhir 5’-P dari dua rantai yang tidak terjalin utuh (Fig. 6-20, B). DNA polymerases tidak mampu ‘mengisi’ ikatan covalent yang hilang. Nick yang tersisa direkat oleh DNA ligase. Enzim ini mengkatalis pembentukan ikatan phosphodiester antara 3’ – OH dari salah satu helaian dari 5’-P dari halaian yang lain.

DNA ligase diaktifkan oleh AMP (adenosine monophosphate) sebagai ‘cofactoor’ (faktor pengendali). Dalam E.coli, AMP dibawa dari nucleotide NAD+. Dalam sel-sel eukaryotik, AMP ditandai dari ATP. Ligase-ligase tidak dilibatkan dalam pemanjangan rantai; melainkan, mereka berperan pemasang enzim-enzim untuk perekatan ‘nicks’ melalui molekul DNA.



MODIFIKASI POST-REPLIKASI DNA

Setelah DNA direplikasikan, dua helaian tersintesis terbaru dipasangkan ke modifikasi enzimatik. Perubahan-perubahan ini biasanya melibatkan penambahan molekul-molekul tertentu untuk mekhususkan titik-titk sepanjang helix ganda. Pada cara ini, tags sel, atau label-label, DNA, sehingga ini bisa membedakan material genetiknya sendiri dari berbagai DNA asing yang mungkin bisa masuk ke dalam sel. Modifikasi post-replikasi DNA mungkin juga mempengaruhi cara molekul diikat.

DNA merupakan faktor utama modifikasi dengan penambahan kelompok methyl ke beberapa adenine dan residu-residu cytosine. Grup methyl ditambahkan oleh DNA methylasess setelah nucleotides telah digabungkan dengan DNA polymerases. Penambahan methyl ke cytosine membentuk 5-methylcytosine dan methylasi dari adenine membentuk 6-methyladine. Methyladine lebih umum daripada methylcytosine dalam sel-sel bakterial, di mana dalam sel-sel eukaryotik, grup methyl paling banyak ditambahkan ke cytosine. Methylase muncul hanya pada beberapa rentetan nucleotide khusus. Dalam sel-sel eukaryotik, sebagai contoh, methylasi secara umum muncul pada saat cytosine berdampingan ke guanine di sisi 3’-OH (5’ P-CG-3’OH).

Pola methylasi bersifat spesifik untuk spesies yang diberikan, berperan seperti tanda tangan untuk DNA spesies tersebut. Hal ini patut diperhatikan karena grup methy melindungi DNA melawan perlawanan enzim-emzim tertentu disebut ‘restriction endonucleoses’ (Fig. 6-21). Oleh karena itu DNA asing melalui sebuah sel dicerna dengan ‘restriction endonucleases’. Dalam sel tertentu, ‘restriction endonucleases’ bisa memotong DNA di titik khusus tertentu di mana DNA methylase menambah sebuah grup methyl. Pola methylasi melindungi DNA dari cernaan oleh sel yang memiliki endonucleases tapi tidak melawan pembatasan enzim-enzim yang diproduksi sel-sel spesies yang lain. Pembatasan ini menyederhanakan pertukaran DNA antar sel dari spesies yang diproduksi sel-sel spesies yang berbeda. ‘Restriction endonucleases’ akan didiskusikan lebih lanjut di Bab 7 ketika topik rekombinasi dan teknik genetis disampaikan lebih lanjut.

Methylasi DNA pada titik-titik tertentu mungkin akan berakhir pada konversi terdekat dari B-DNA ke bentuk-bentuk Z-DNA. Dalam bentuk B-DNA, grup-grup hydropholic methyl dari alur utama, menghasilkan pengaturan yang tepat.. Dengan mengubahnya ke bentuk Z, grup-grup methyl membentuk area hydropholik yang membantu menstabilkan DNA. Konversi lokal ini (dari B-DNA ke Z-DNA) mungkin mempengaruhi fungsi beberapa gen.

6-2 TRANSKRIPSI: PEMINDAHAN INFORMASI DARI DNA KE RNA

Proses penggunaan informasi dalam DNA untuk melangsungkan sintesis protein menggunakan molekul RNA intermedier. Jika DNA dibandingkan kepada sebuah ensiklopedia yang mengandung pandangan informasi umum dan ditempatkan di ruangan pustaka, RNA mungkin sebuah salinan dari lapisan-lapisan di ensiklopedia informasi. Salinan multipel RNA bisa dibuat tanpa mengancam kerusakan potensial ke informasi referensi yang disimpan dalam RNA.

Transkripsi adalah proses penyimpanan informasi dalam DNA digunakan untuk menandai sintesis RNA. Transkripsi sama dalam beberapa cara ke replikasi DNA tapi ada beberapa perbedaan utama antara sintesis RNA dan DNA. RNA yang disintesiskan adalah helaian-helaian tunggal. Selanjutnya, untuk area yang diberikan, hanya satu helaian dari DNA ditandai untuk sintesis RNA yang dikenal sebagai ‘sense strand’. Area-area yang berbeda dari masing-masing helaian dari DNA, bagaimanapun, bisa berperan sebagai ‘sense strands’ (helaian-helaian rasa). Istilah ini diaplikasikan hanya ke area tertentu dari DNA yang sedang ditranskripsikan. Dalam transkripsi, helaian panca indera DNA mencapai pemindahan informasi penting untuk ekspresi kejadian dari informasi genetik.



ASAM RIBONUCLEIC – RNA

Dalam semua sel makhluk hidup, makromolekul RNA berperan sebagai mediator informasi antara DNA di mana informasi genetik disimpan dan protein-protein yang secara langsung mengekspresi informasi. Lalu RNA dilibatkan sebagai pembawa informasi genetik bersama sel. Transkripsi DNA berakhir dalam produksi tiga kelas dari RNA:rRNA, tRNA, dan mRNA.

RNA secara kimiawi sama dengan DNA yang terdiri atas nucleotides (Fig. 6-12). RNA adalah sebuah helaian ribonucleotides dihubungkan oleh ikatan 3’-5’ phosphodiester dengan 3’-OH akhir bebas dan 5’-P akhir bebas. Ribose, daripada deoxyribose, muncul dalam nucleotides RNA. Grup ekstra hydroxyl yang muncul dalam ribose dibandingkan ke deoxyribose membuat RNA sebuah struktur kurang stabil daripada DNA. RNA, seperti DNA, mengandung adenine, guanine, dan cytosine, tapi RNA mengandung pyrimidine uracil (U), dan uridine nucleotides (urydite) daripada thymine.

Tambahan lagi, RNA aktif terutama sebagai helaian tunggal, berlawanan ke helix ganda di DNA. Bagaimanapun, banyaknya rantai RNA bisa direkat kembali ke jaringan mereka sendiri dan membentuk pasangan landasan ikatan-hidrogen G-C sama dengan yang terdapat di DNA, sama halnya dengan pasangan landasaqn ikatan hidrogen antara A dan U. Molekul-molekul RNA mengandung area helaian tunggal dan area helaian-helaian ganda dengan struktur yang disebut ‘hairpin loops’ yang diciptakan oleh topologi tiga-dimensi mereka (Fig. 6-23).

Messenger RNA (mRNA)

mRNA mengandung kode yang ditranskripsikan dari informasi genetik DNA dan kemudian digunakan untuk mengkhususkan rentetan asam amino dalam sintesis protein (Fig. 6-24). Di dalam sel-sel bakterial dan archaeal biasanya terdapat satu penandaan rentetan DNA untuk mRNA tertentu. Dalam sel-sel eukaryotik terdapat banyak salinan gen-gen untuk molekul mRNA yang sama. Dalam bakterial, sel-sel archaeal dan eukaryotik, terdapat kemungkinan untuk bisa memiliki banyak salinan dari makromolekul mRNA tertentu, membiarkan lokasi-lokasi protein multipel sintesis untuk produk yang sama.

Dalam bakteria dan archaea, molekul mRNA ditranskripsikan secara langsung dari rentetan DNA. RNA membawa informasi ditandai untuk protein-protein ke ribosomes di mana ini diterjemahkan secara langsung. Seringkali, bakteri dan archaeal mRNA merupakan ‘poly cistronic’, mengandung informasi untuk beberapa protein, biasanya dengan fungsi yang berkaitan. Kemungkinan terdapat area luas yang tidak diterjemahkan antara area DNA untuk protein-protein yang berbeda ini. mRNA yang dibentuk dalam sel-sel eukaryotik merupakan ‘monocistronic’ (mengandung penerjemahan untuk satu rentetan polypeptide), dan proses penerjemahan dipisahkan secara temporal.

Panjang umur bakteri dan eukaryotik mRNA berbeda secara drastis. Dalam sel-sel bakteri kebanyakan molekul-molekul mRNA bertahan hanya dalam beberapa menit. Dalam sel-sel eukaryotik kebanyakan molekul mRNA bisa berfungsi sekitar beberapa jam atau satu hari. Periode yang panjang dari aktifitas sebuah molekul mRNA dalam sel eukaryotik memberikan tingkat kestabilan relatif ke pemenuhan protein dibandingkan ke perubahan situasi dalam sebuah sel bakterial di mana molekul-molekul mRNA didegradasi dengan cepat. Selmbakterial, sebagai hasilnya, bisa mempengaruhi dengan cepat metabolisme dalam merespon kondisi lingkungan yang berubah, sebagaimana dengan mikroorganisme eukaryotik diadaptasi dengan lebih baik pada untuk metabolisme berkelanjutan dalam lingkungan yang stabil.

Transfer RNA (tRNA)

tRNA merupakan rentetan mRNA atau menerjemahkannya menjadi rentetan asam amino yang benar. Dia membawa asam amino khusus ke ribosome di mana sintesis protein muncul. Pemindahan molekul-molekul mRNA relatif pendek, mengandung sekitar 70 hingga 80 ribonucleotides. Meskipun molekul-molekul RNA berhelaian-tunggal, mereka bisa memeluk kembali dari mereka sendiri, menetapkan area helaian ganda. Molekul-molekul tRNA memiliki area helaian-ganda ekstensif yang uncul dari perekatan ranati RNA utama. Molekul-molekul ini direkat ke dalam struktur tiga-dimensi yang mirip atau menyerupai daun cengkeh tiga lembar (Fig. 6-25). Setiap empat daun telinga dari tRNA memiliki karakteristik rentetan nukelotides dan fungsi-fungsinya. Keempat bagian dari molekul RNA memeluk kembali diri mereka sendiri oleh G – C dan A – U pemasangan landasan untuk membentuk area helaian ganda stabil disebut ‘stems’. Di luar dari tiga atau empat stems merupakan ‘hairpin loops’. Struktur stem-loop ini kemudian dilipat secara tiga-dimensi untuk membentuk struktur berbentuk - ∟.

Asam nucleic dalam molekul-molekul tRNA domodifikasi secara enzimatik setelah molekul RNA telah disintesiskan. Nucleotides khusus di-methylasi-kan, di-hydroginasi-kan, atau diatur untuk membentuk nukleotides jarang seperti pseudorine (ψ), thymidine (T), dan dihydroudirine (DHU), yang tidak ditemukan dalam berbagai tipe RNA lainnya. Archaeal tRNAs secara sistematis kekurangan ribothymidine dan 7-methylguosinine, yang dimodifikasi ribonucleotides ditemukan dalam bakterial tRNAs dan sel-sel eukaryotik.

Perubahan-perubahan dalam rentetan tRNA lebih bersifat konstan untuk semua molekul-molekul tRNA. Mereka mengandung ikatan D, ikatan TψC, dan sebuah ikatan anticodon. Stem yang keempat dari struktur cloverleaf (daun cengkeh) adalah stem asam amino, yang mana asam amino khusus dibawa dan dipasangkan ke ribosome selama sintesis protein. Ikatan anticidon mengandung tiga pendamping nucleotides, anticodon, yang bisa membentuk pasangan landasan tambahan dengan tiga nucleotides dalam mRNA codon.

Ribosomal RNA (rRNA) dan Ribosomal Protein-Protein

Molekul rRNA mencakup komponen utama ribosomes; ribosomes yang tersisa terbagi atas protein-protein ribosomal. Daun telinga dari rRNA diasosiasikan dengan fungsi spesifik, seperti lokasi amino acyl di mana asam amino baru disejajarkan untuk penyatuan beberapa peptide, lokasi peptidyl di mana peptide yang sedang tumbuh ditempelkan ke ribosome, dan lokasi pengikatan mRNA di mana informasi mengkhususkan perintah asam amino dalam peptide dibawa. Struktur tiga-dimensional ribosome penting untuk peran fungsionalnya dalam sintesis protein. rRNA lebih penting dalam pengaturan struktural protein-protein ribosome. RNA lebih banyak memiliki peran struktural dalam ribosome. Hal ini juga penting dalam menempatkan tRNAs d\alam ribosome dan telah ditunjukkan untuk mengandung peptidyl transferase yang terlibat dalam formasi ikatan peptide.

rRNA merupakan molekul berstruktur tinggi yang melipat ke daun telinga distinct (mencolok). Sebagai contoh, terdapat empat bidang 16S rRNA yang ditemukan dalam sel-sel bakterial dan archaeal (Fig. 6-26). Beberapa nucleotides dari rRNA di-methyl-kan. Sebagai contoh, terdapat sekitar 10 grup methyl dalam E.coli rRNA ditempatkan berdekatan dengan akhir 3’-OH dari molekul.

Ribosomes dan molekul-molekul mRNA bakterial, archaeal, dan sel-sel eukaryotik berbeda (Fig. 6-27). Dalam sel eukaryotik, subunit kecil 40 S mengandung satu 18 S (1.900 nucleotides) rRNA dan subunit besar 60 S mengandung masing-masingnya 28 S (4.800 nucleotides), 5,8 S (160 nucleotides), dan 5 S (120 nucleotides) rRNA molekul. Dalam sel-sel bakteri dan archaeal, subunit ribosomal kecil 30 S mengandung satu molekul 16 S rRNA, yang terdiri atas sekitar 1.540 nucleotides, dan subunit rhibosomal besar 50 S terdiri atas 23 S mokelul rRNA (2.900 nucleotides) dan satu 5 S rRNA (120 nucleotides).

Berbagai protein-protein rhibosomal diasosiasikan juga dengan rRNA. Rhibosome E.coli mengandung tiga molekul RNA dan 52 protein. Rhibosomes mamalia mengandung empat molekul RNA dan 82 protein. Protein-protein ini diasosiasikan dengan lokasi khusus rRNA. Protein yang diasosiasikan dengan subunit ribosomal terkecil (30 S dalam sel bakterial dan archaeal dan 40 S dalam sel eukaryotik), disebut protein 5. Protein-protein yang diasosiasikan dengan subunit ribosomal terbesar (50 S dalam sel bakterial dan arcaeal dan 60 S dalam sel-sel arcaheal), disebut protein ∟. Beberapa protein ribosomal tertentu dalam sel-sel archaeal lebih berdekatan menyerupai protein ribosomal sel-sel eukaryotik daripada yang dilakukan sel-sel bakterial.

Dalam sel bakterial, subunit ribosomal 30 S mengandung 32 % hingga 33 % protein dan 50 S ribosomal subunit mengandung 40 % hingga 42 %. Protein yang mirip secara virtual, bagian dalamnya (isi) telah ditemukan dalam semua bakteria yang diuji.

Di dalam sel-sel archaeal, ribosomes jatuh menjadi dua kelas-kelas dengan isi protein. Ribosomes dari cre narchaeota, yang termasuk archaea yang hidup dalam temperatur tinggi, memiliki ribosomes paling berat daripada yang ditemukan dalam sel-sel bakteri. Tibosomes dari crenarchaeota memiliki subunit terasosiasi mingguan. Penggunaan dari ribosomes ini di dalam sintesis protein bergantung kepada konsentrasi tingkat tinggi dari spremine asam amino dan dihalangi ino-ion NH4+.

Bertentangan dengan hal di atas, ribosomes dari euryarchaota, yang termasuk beberapa archaea yang hidup dalam temperatur tingkat tinggi dan beberapa yang hidup dalam temperatur tingkat tinggi dan beberapa yang hidup dalam lingkungan dengan konsentrsi garam yang tinggi, memiliki isi protein seperti yang dimiliki crenarchaeta. Sedangkan yang lainnya memiliki isi-isi protein seperti yang dimiliki oleh sel-sel bakterial. Ribosomes dari euryarchota memiliki subunit protein tidak bergantung dari soermine dan secara kuat bergantung dengan ino-ino NH4+.

SINTESIS TRANSKRIPSI – RNA

Sintesis RNA muncul selama ‘transcription’. Proses ini melibatkan molekul DNA helix ganda yang belum terikat untuk rentetan pendek dari landasan nucleotide, jalinan dari ribonucleotides dengan pemasangan landasan berlawanan terhadap nucleotides dari helaian DNA yang sedang di-transkrib-kan, dan terjalin ke nucleotides tersebut dengan ikatan-ikatan phosphodiester dengan RNA polymerase DAN-mandiri. Proses berlangsung pada sebuah lokasi di mana ikatan RNA dan memproses melalui 3’-OH akhir sampai pangkalana muncul (Fig. 6-28). Pengikatan RNA polymerases bisa menghubungkan nucleotides hanya ke 3’-OH akhir bebas dari polymer. Lalu sintesis RNA yang disintesiskan dalam transkripsi bersifat antiparalel ke helaian DNA yang berfungsi sebagai ‘template’.

RNA POLYMERASES

Enzim-enzim yang mensintesis RNA dari ribonucletides merupakan DNA-mandiri RNA polymerases. Enzim-enzim ini bisa membentuk ikatan phosphodiester antara dua ribonucleotides hanya sepanjang terjalin berlawanan ke nucleotides template DNA tambahan. Berbeda dengan replikasi DNA, sintesis RNA tidak membutuhkan senuah bagian utama (Tabel 6-5).

Bakteria memiliki satu tipe dasar RMA polymerase yang mensintesis semua (tiga kelas) dari molekul-molekul DNA. Dalam E.coli, hanya ada satu bentuk, meskupun bakteria lainnya mungkin memiliki beberapa jenis dari tipe dasar RNA polymerase. Dalam E.coli, RNA polymerase pada dasarnya sebuah kompleks dari empat subunit protein yang membentuk enzim inti (Fig. 6-29). Subunit ini dilabelkan dengan α, β, dan β’. Terdapat dua salinan dari subunit α dalam enzim inti dan setiap satu salinan dari subunit β dan β’. Sebagai tambahan pada protein ini terdapat faktor sigma (σ), yang terlibat dalam inisiasi sintesis RNA, dan sebuah omega (ω), yang berfungsi dalam transkripsi yang tidak jelas pada waktu yang sama. Bakterial RNA polymerases dicangkokkan dengan rifampicin dan streptolydgin, yang mengikat ke subunit β dan menjaga RNA polymerases dari proses inisiasi sintesis RNA.

Archaea memiliki RNA polymerases yang unik. Hal ini mengandung 8 sampai 12 polypeptides tapi berbeda dalam hal ukuran dan sejumlah salinan setiap subunit dalam inti enzim, dalam archaea yang berbeda. Semua archaea RNA polymerases yang diuji sejauh ini terlihat begitu sensitif ke antibiotik rifampicin dan streptolydgin. Archaeal RNA polymerases menunjukkan persamaan yang lebih tinggi ke aukaryotik RNA polymerases daripada bakterial RNA polymerases. Setiap spesies archaeal hanya memiliki satu tipe RNA polymerase, tapi archaea yang berbeda memiliki RNA polymerase yang sama dengan semua tiga tipe RNA polymerases yang ditemukan dalam sel-sel eukaryotik berdasarkan atas rentetan nucleotide dari gen-gen mereka.

Terdapat kumpulan khas dari gen-gen yang ditandai untuk RNA polymerases dalam sel-sel archaeal yang berbeda dari sel-sel bakterial dan eukaryotik (Fig. 6-30). Ada beberapa pengelompokan gen-gen yang mengandung satu kumpulan gen kecil, rpoH, diikuti oleh gen –gen dari komponen besar rpoB1 dan rpoB2 yang ditandai untuk subunit B’-B” diikuti oleh rpoA1 dan rpoA2 yang ditandai untuk subunit A’ dan A”. Arcaheal RNA polymerases (subunit B) lebih sensitif terhadap rifampicin dan streptolydgin.

Sel-sel eukaryotik memiliki tiga enzim-enzim RNA polymerase yang mencolok, dan bertanggungjawab untuk sintesis tiga kelas berbeda dari RNA. Enzim-enzim ini cukup kompleks dan disusun atas 9 – 12 subunit atau lebih. RNA polymerase I mensintesis rRNA, RNA polymerase II memiliki tingkat kesensitifan tinggi terhadap kimia yang diproduksi oleh beberapa jamur. Semua eukaryotik RNA polymerases sensitif terhadap rifampicin dan sytreptolydgin (antibiotik yang menghalangi bakterial RNA polymerase).

Inisiasi Transkripsi

Proses pengiriman informasi dari DNA ke RNA memiliki transkripsi dimulai dari lokasi yang tepat. Ada beberapa lokasi inisiasi untuk transkripsi sepanjang molekul DNA dalam bakterial, archaeal, dan sel-sel eukaryotik. Lokasi inisiasi berbeda diperlukan untuk memulai sintesis dari kelas yang berbeda dari RNA dan sintesis RNA untuk rentetan polypeptide yang berbeda. Ada juga beberapa lokasi khusus untuk pemberhentian transkripsi khusus mulai dari berhenti (tanda), hal ini mungkin untuk menempatkan area yang disebut ‘open reading frame’, ini sesuai untuk gen.

Promoter-promoter (Pendukung)

Tanda apa dalam molekul DNA untuk memulai membaca gen khusus? DNA mengandung rentetan khusus nucleotide, dikenal sebagai ‘pomoter regions’, yang berperan sebagai penanda untuk inisiasi transkripsi. Area pendukung DNA adalah lokasi di mana RNA polymerase mengikat untuk traskripsi. Keaktifan ‘promoter region’ mengkhususkan:
[1] lokasi inisiasi transkripsi, dan
[2] di mana dari dua helaian DNA bakteria berfungsi sebagai helaian perasa untuk transkripsi di area tersebut.

Kawasan promoter dalam DNA bakteria yang telah diujikan terdiri atas kira-kira 40 nucleotides dan mengandung tujuh rentetan nucleotide, dikenal sebagai ‘Pribnow sequence’ (rentetan Pribnow), yang muncul menjadi bagian kunci dari tanda pengenalan (Fig. 6-31). Rentetan Pribnow memunculkan sekitar 5 atau 8 landasan nucleotide (dalam arah 5’-P) dari permulaan aktual transkripsi. Tujuan akhir “upstream” mengindikasikan bahwa ini di-transkrib-kan karena nucleotide bagian bawah. Semenjak rentetan Pribnow memiliki tujuh nucleotides, menabrak posisi ke-10, yaitu lokasi 10 nucleotide dari gen yang di-transkrib-kan.

Rentetan Probnow mengandung rentetan nucleotides yang sama atau hampir sama dengan TATAAT untuk berbagai pendukung bakterial yang telah diujikan. Tipe ini disebut ‘concensus sequence’ (rentetan konsensus). Rentetan konsensus Pribnow mulai dari posis ke 10 dalam DNA. Rentetan konsensus ke dua, TTGACA, ditempatkan pada pendukung posis ke 35.

Rentetan konsensus konservasi tinggi (identik secara virtual) untuk inisiasi transkripsi telah ditemukan dalam semua sel-sel eukaryotik. ‘Transcription factors’ (TFs) mengikat ke DNA pada lokasi promoter khusus secara independent dari RNA polymerases. RNA polymerases II membutuhkan empat faktor transkripsi: TFIIA, TFIIB, TFIID, dan TFIIE. Transkripsi RNA polymerase II menjadi pendukung dalam sel-sel eukaryotik, yang membutuhkan pengikatan TFIID, juga disebut faktor TATA. Faktor TATA adalah faktor transkripsi protein yang mengikat ke rentetan DNA kaya akan A-T disebut ‘TATA box’ (kotak TATA) =
5’ --- TATA ( T ) A ( T )
A A
Rentetan konsensus terkonversi ini dipusatkan sekitar -25 nucleotides dari nucleotide permulann dan analogous ke rentetan konsensus -10 dalam sel-sel bakterial. Dalam sel-sel eukaryotik, faktor transkripsi IIB (IFIIB) memainkan peran lebih awal dalam inisiasi transkripsi oleh RNA polymerase II (PolII). Faktor transkripsi pertama IID (TFIID) mengikat kotak TATA merupakan lokasi pengenalan penting untuk inisiasi transkripsi yang berujung kepada sintesis protein dari sel-sel eukaryotik.
Ada perbedaan mencolok dalam rentetan konsensus bakterial melawan sel-sel archaeal dan eukaryotik. Archaeal DNA polymerases mengenali lokasi inisiasi (pendukung) yang sama dengan sel-sel eukaryotik. Transkripsi penentu dasar utama inisiasi oleh archaeal methanogens adalah =
5’ --- TTTA ( T ) ATA
A

Faktor Sigma Bakterial

Pendekatan inisial bakterial enzim inti RNA polymerase (α2 β β) ke area pendukung bergantung kepada kehadiran faktor sigma (σ) – Fig. 6-29. Tanpa subunit sigma, RNA polymerase gagal untuk membentuk kekhususan penting dalam pengenalan lokasi inisiasi untuk transkripsi. Faktor Sigma kemudian meyakinkan bahwa sintesis RNA mulai di lokasi yang tepat.




Pemanjangan Selama Transkripsi

RNA polymerase sempurna (inti + unit sigma) yaitu ‘holoenzime’. RNA polymerase holoenzyme pertama mengikat ke DNA promoter pada rentetan konsensus -35, membentuk ‘closed complex’. RNA polymerase holoenzyme kemudian memisahkan ikatannya ke rentetan Pribnow – 10. Selanjutnya, DNA helix dilepaskan untuk membentuk area helaian-tunggal dan sebuah ‘open complex’. RNA polymerase holoenzyme memulai transkripsi. Nucleotide pertama ditambahkan biasanya purine (adenosine atau guanosine). Setelah formasi sekitar 10 ikatan phosphodiester antara ribonucleoses, subunit sigma dilepaskan dari RNA polymerase dan sisi dari molekul RNA disintesiskan atau dipanjangkan oleh inti RNA polymerase. Subunit sigma kemudian bebas untuk bergabung dengan molekul RNA polymerase lainnya, melengkapi molekul tersebut dan menetapkan tingkat kekhususan yang penting untuk pengikatan lokasi inisiasi transkripsional yang baru.

Bakteria biasanya memiliki faktor-faktor σ multipel; masing-masingnya bertanggungjawab atas pengenalan rentetan inisiasi promoter tertentu. Faktor σ utama dalam E.coli adalah σ70, dengan σ54, σ32, dan σ20, normalnya menampilkan konsentrasi tingkat rendah. Superscript diasosiasikan dengan masing-masing faktor σ mewakili berat molekul dari protein x 10 -3. Di bawah perubahan tertentu dalam kondisi lingkungan, σ54 atau σ32 meningkat dalam kensentrasinya dan melangsungkan RNA polymerase untuk mengikat diri pada rentetan konsensus promoter lainnya. (TTGCA untuk σ54 dan CCCCAT untuk σ32), yang berbeda dari rentetan Pribnow dikenali dengan σ70. Sebagai hasil dari mekanisme kontrol ini, regulasi dari konsentrasi dari faktor-faktor yang berbeda dalam sel membawa ke transkripsi khusus dari gen-gen tertentu dan bukan yang lainnya.




Kekuatan pendukung --------- Interaksi RNA polymerase dengan Promoters.

Ketiga kawasan penting promoters yang berdampak pada bagaimana berfungsi dan efisiensi dari transkripsi adalah kawasan konsensus -35, rententan konsensus Pribnow -10, dan lokasi inisiasi. Rentetan konsesus -35 merupakan lokasi pengenalan inisial antara RNA polymerase dan DNA, dan rentetan konsensus Pribnow -10 merupakan pusat dari kawasan DNA yang tidak diikat. Rentetan nucleotide secara langsung melingkupi poin permulaan. Inisiasi transkripsi mungkin juga mempengaruhi inisiasi dan betapa cepatnya RNA polymerase meninggalkan lokasi promoter. Semua fitur-fitur ini memiliki sebuah pengaruh kepada tingkat efisiensi RNA polymerase untuk transkripsi. Promoters dengan rentetan nucleotide melalui RNBA polymerase ditujukan sebagai ‘promoter kuat’. Promoters dengan rentetan nucleotide yang membantu transkripsi yang kurang efisien melalui RNA polymerase merupakan ‘promoters lemah’.

Penambahan dari rentetan nucleotide pada tiga kawasan penting juga dipengaruhi oleh kemampuan memisahkan helaian-helaian DNA. Pemisahan helaian secara langsung dipengaruhi oleh komposisi nucleotide (kawasan AT-rich lebih mudah dipisahkan daripada kawasan GC-rich) dan dengan tingkatan supercoiling adri helix ganda. Bakterial, archaeal dan eukaryotik RNA polymereases bisa menginisiasi transkripsi lebih mudah pada kebanyakan promoters ketika DNA di-seupercoilkan daripada dibebaskan. Pertentangan dengan aktifitas topoisomerases, yang secara tidak langsung memperngaruhi transkripsi.

Penyesuaian DNA juga memeprngaruhi kekuatan promoter. Dalam sel-sel bakteri, RNA polymerase mengikat DNA berakhir dalam pelurusan DNA, perubahan kekuatan dari promoter. Pembelokan DNA merupakan peran penting dalam ekspresi gen karena ini mempengaruhi interaksi DNA dengan faktor sigma DNA polumerases yang menetapkan kekuatan promoter.



Pemanjangan Selama Transkripsi

Sekali DNA polymerases telah menetapkan inisiasi transkripsi yang berhasil (pembentukan sebuah ‘open complex’, dan polymerisasi 9 – 10 nucleotides) eenzim melepaskan fator sigmanya. Hal ini meninggalkan ‘ternary complex’ dari RNA polymerase-DNA-terbaru mensintesis helaian RNA. RNA polymerase kemudian bergerak sepanjang template DNA dan memperpanjang helaian RNA yang sedang tumbuh. Ribonucleotides baru ditambahkan pada tingkatan 40 nucleotides setiap detik pada temperatur 37˚ C yang lebih lambat dari replikasi DNA (1.000 deoxyribonucleotides per detik).

Tingkat kecepatan polymerisasi RNA selama transkripsi mungkin tidak akan berjalan lancar, penambahan berkelanjutan atas ribonucleotides. Di dalam ‘operons’ yang mengandung sebuah area ‘attenuator’, terdapat lokasi khusus sepanjang DNA yang menyebabkan RNA polymerase berhenti atau diam sejenak sampai kondisi-kondisi tertentu dipertemukan. Jika kondisi terpenuhi, RNA polymerase bisa memproses dengan pemanjangan. Jika kondisi tidak terpenuhi, RNA polymerase menghentikan transkripsi.

Terminasi transkripsi (Titik Akhir Transkripsi)

Ada beberapa lokasi terminasi khusus yang berperan sebagai sebuah sinyal untuk menghentikan transkripsi. Dalam bakteria, lokasi transkripsi ini mungkin berujung dalam rentetan RNA yang telah ditranskripsikan atau dalam template DNA. Terminasi tanskripsi bakterial berada pada dua tipe:
[1] simel atau rho (ρ) - independent terminasi, yang tidak membutuhkan berbagai faktor tambahan, dan
[2] rho (ρ) - dependent terminasi, yang memerlukan protein tambahan, faktor rho (ρ)



Terminasi mandiri – rho meliobatkan rentetan terminasi dengan sebuah limpahanlandasan GC dalam transkriip DNA, diikuti oleh serentetan beberapa sisa uridine (U) – Fig. 6-32. Area yang kaya dengan GC membentuk pola simetris yang memperkuat RNA yang tersintesis untuk melipat kembali diri sendiri, membentuk sebuah stem (tangkai) dan loop (gulungan). Rentetan ini menyebabkan RNA polymerase berhenti sementara selama 60 detik dan titik akhir sintesis RNA. Sinyal terminasi aktual mungkin bersisa dalam rentetan uracils, selama modifikasi (pemendekan) rentetan ini menjaga terminasi dari kemunculan.

Dalam terminasi ρ- dependent, terminasi transkripsi membutuhkan kehadiran protein rho (ρ) tambahan. Terminasi ρ-dependent ini tidak membutuhkan kehadiran uridines atau area GC-rich untuk mempengaruhi terminasi. Tidak ada rentetan konsensus umum yang menjelaskan sinyal terminasi ρ-dependent. Hal ini dipercayai bahwa protein ρ mengikat perkembangan helaian RNA dan bergerak sepanjangnya melalui RNA polymerase dalam arah 5’-P → 3’-OH ketika RNA polymerase berhenti sementara pada rentetan terminasi, protein ρ menangkapnya dan menyebabkan pelepasan ρ-dependent bukan merupakan mekanisme umum transkripsi dalam sel-sel bakterial.

MODIFIKASI POST-TRANSKRIPSIONAL RNA

RNA dibentuk melalui transkripsi, bisa dimodifikasi secara berentetan untuk memproduksi berbagai molekul RNA. Modifikasi post-transkripsional dari rRNA dan tRNA muncul dalam bakterial, sel-sel archaeal dan eukaryotic. Dalam sel-sel eukaryotic mRNA dimodifikasi dengan ekstensif. Bagaimanapun, mRNA dalam sel-sel archaeal dan bakterial tidak dimodifikasi dalam jarak dekat ke rentangan bahwa mereka berada dalam sel-sel eukaryotik dan seringkali dimodifikasi seluruhnya setelah transkripsi. Kenyataannya berbagai mRNA bakterial dan archaeal sampai ke ribosomes dan kemudian diterjemahkan bahkan jauh sebelum transkripsi dilengkapi.


Modifikasi post-transkripsional RNA mungkin berakhir dalam pemindahan beberapa rentetan nucleotides, penambahan atas beberapa nucleotides atau modifikasi nucelotides tertentu disebut ‘introns’ dan menggabungkan secara bersama dari pemindahan rentetan disebut ‘exons’.

Pengikatan RNA melibatkan perusakan jalinan phospshodiester pada perbatasan exon-intron (penggabungan hubungan-splicing junctions) dan membentuk ikatan baru antara bagian akhir dari exon-exon. Dalam perilaku ini intron-intron dipindahkan (dipotong) dan exon-exon digabungkan secara bersama. Pemotongan intron bisa menjadi bagian dari RNA itu sendiri, yaitu, oleh autocatlysis, di mana RNA mungkin berperan sebagai ‘ribozyme’ (molekul RNA katalis) untuk memindahkan intron-intron. Pengenalan penggabungan ‘junctions’ (persimpangan) mungkin terjadi karena konformasi khusus RNA.

Beberapa tipe intron-mekanisme pemindahannya telah diidentifikasi (Tabel 6-6). Grup I intron tidak menghubungkan rentetan nucleotide pada penggabungan ‘junctions’ tapi memiliki rentetan nucleotide internal yang dilestarikan. Grup I intron mengalami proses penempelan diri sendiri di mana RNA mengkatalis ikatan phosphodiester. Pengikatan diri sendiri pada gen bergantung dari kehadiran rentetan konsensus pendek yang mungkin ditempatkan pada jarak yang tepat dari penggabungan. Struktur gulungan kedua yang mencolok berkembang karena pemasangan landasan antara rentetan konsensus nukleotides dan gulungan dibelah dari RNA. Semia grup I netrons memiliki rentetan konsensus pendek yang menurunkan struktur ke dua dalam intron karena pemasangan landasan. Oleh karena aktifitas pemasangan landasan merupakan bagian intrinsik dari molekul RNA yang dipotong, aktifitas tersebut kemudian disebut ‘autosplicing’ atau penggabungan-sendiri.

Grup II intron memiliki rentetan konsensus pada penggabungan yang terdiri dari

GT di bagian akhir pada dan A ( C ) untuk bagian lainnya. Pemotongan grup II
T
intron muncul pada struktur lariat (gulungan sirkular dengan ekstensi linear) – Fig. 6-33. Grup II introns bisa dipindahkan melalui reaksi pengikatan sendiri.
Intron-intron dipindahkan dari ‘heterogenous nuclear RNAs (hnRNAs)’ dalam nuclei sel eukaryotik melalui sistem yang lebih dielaborasi yang mengenali rentetan konsensus pendek pada penghubung dan dalam intron-intron. Proses post-transkripsional hnRNAs memindahkan intron-intron dari spesies-spesies bersamaan dengan exon-exon (Fig. 6-34). Bagian dari proses hnRNA melibatkan pemotongan intron-intron untuk membentuk molekul mRNA dewasa, yang kemudian bisa diterjemahkan oleh ribosomes. Persimpangan exon-intron memiliki rentetan GU-rich pada bagian akhir 3’-OH –nya. Proses ini mempermudah pengenalan dari perbatasan-perbatasan antara exon-exon dan intron-intron sehingga area-area yang sesuai dipindahkan dan pemasangan utama muncul.

Pengaturan kembali molekul-molekul RNA dijelaskan (diolah) dari DNA untuk membentuk molekul mRNA dewasa melibatkan pemotongan dan pemasangan bersama bagian-bagian RNA untuk membentuk mRNA fungsional. Penggabungan hnRNA (pra-mRNA) melibatkan kumpulan nuklir kecil RNAs (snRNAs) dan partikel-partikel protein-ribenucleo nuklir kecil (snRNPs). snRNPs (SNURPS) dibentuk dari snRNPs terlibat dalam pembentukan mRNA terikat disebut ‘splicesome’. snRNPs mengenali lokasi di mana pengikatan seharunya muncul, dengan beberapa snRNPs mengenali ujung 5’-P dan yang lainnya mengenali ujung 3’-OH. Dalam beberapa kasus perekatan dikataliskan oleh ribosomes. Aktifitas – aktifitas splicesome muncul hanya dalam nuclei sel-sel eukaryotic.

rRNA

Dalam bakterial, sel-sel archaeal dan eukaryotic, molekul-molekul RNA ditransipsikan dari DNA lebih besar daripada molekul – molekul rRNA, ditemukan dalam ribosomes (Fig. 6-35). Prekursor molekul-molekul rRNA kemudian harus diproses untuk membentuk molekul-molekul rRNA. Ribosomes sel-sel archaeal dan bakterial mengandung 5 S, 16 S, dan Rna 23 S, tapi transkrip inisial dari DNA adalah sebesar molekul 30 S yang diikat oleh enzim-enzim nuclease untuk membentuk molekul-molekuk RNA ukiran berbeda tersebut. Lima intron-intron pra-23 S rRNA telah ditemukan dalam hyperthermophillic archaea. Intron-intron ini mengandung struktur inti yang terdiri atas struktur gulungan-cabang, stabil dan panjang. Persimpangan exon-intron dikenali melalui pemecahan enzim dan sebuah inti pasangan. Setelah pemotongan dari transkrip rRNA, intron-intron mensirikulasi dan dengan stabil dipertahankan dalam sel.

Prekursor besar terpisah seringkali digunakan untuk produksi molekul-molekul 5 S rRNA. Dalam sel-sel eukaryotik molekul RNA prekursor besar dengan bersamaan dibelah untuk membentuk molekul-molekul 28 S, 18 S, dan 5,8 S rRNA yang membuat porsi-porsi RNA untuk bagian ribosomesnya. Pemotongan molekul-molekul rRNA juga memindahkan kawasan atau area leader, trailer, dan spacer yang dimunculkan dalam traskrip RNA asli tapi tidak termasuk ke dalam molekul-molekul rRNA yang disusun melalui ribosomes. Kawasan spacer yang dipindahkan memiliki spesies dengan pola-pola khusus. Analisa dari kawasan ini dalam gen untuk penandaan rRNA bisa digunakan untuk mendiagnosa kehadiran spesies khusus.

tRNA

Molekul-molekul tRNA disintesiskan secara sama sebagai prekursor berat molekuler tinggi yang kemudian diproses untuk memproduksi molekul-molekul tRNA dewasa. Intron-intron muncul dalam tRNAs dar archaeal dan sel-sel eukaryotic tidak muncul dalam tRNAs dari kebanyakan bakteria tapi mereka telah ditemukan dalam beberapa spesies cyanobakterial.

Semua molekul-molekul tRNA memiliki 3’-OH terminus dengan rentetan nucleotide CCA yang munkin ditandai dalam rentetan nucleotide utama atau ditambahkan secara enzimatis sebagai tudung setelah transkripsi dari template DNA. Dengan pengecualian terhadap methanogens, gen-gen archaeal tRNA tidak memberi kode ujung CCA-terminal, membuat mereka seperti sel-sel eukaryotik yang bersamaan menambah CCA sebagai modifikasi post-transkripsional terhadap tRNA. Gen-gen untuk berbagai archaeal tRNAs memiliki intron-intron dalam jarak dekat dari sisi 3’ dari anticodon. Hal ini kemudian membuat hal yang sama ke gen-gen tRNAs atas sel-sel eukaryotik, yang juga memiliki intron-intron yang sama.

Dalam molekul tRNA, beberapa nucleotides dimodofikasi untuk membentuk landasan-landasan nucleotides khusus (tidak seperti biasa) melalui modifikasi post-transkripsional dari RNA nucleotides normal melalui enzim-enzim khusus. Beberapa landasan nucleotides khusus yang ditemukan dalam tRNA merupakan pseudourine, dihydrouridine, ribothymine, dan iosine. Fungsi-fungsi khusus dari landasan-landasa jarang tidak telalu diperhatikan (meskipun beberapa nucleotides dimodifikasi dalam gulungan anticodon telah memperlihatkan pengurangan goyangan) tapi sifat hydropolic mereka mungkin penting dalam interaksi tRNA dan ribosomes. Kehadiran nucleotides jarang dan konfigurasi khusus dari molekul tRNA membedakannya dari kelas-kelas yang lain dari molekul-molekul RNA.

mRNA

Molekul-molekul dari sel-sel eukaryotik dimodifikasi secara umum setelah transkripsi dari DNA untuk membentuk mRNA. hnRNAs kadang-kadang lebih besar dari molekul mRNA akhir dan ditujukan untuk membentuk mRNA. Proses hnRNA melibatkan perpindaan dan penambahan rentetan nucleotide (Fig. 6-36). Ujung 5’-P dari hnRNA dijaga dengan sisa dari guanosine triphosphate (GTP) yang telah dimodifikasi melalui penambahan rentetan adenosine nucleotides (polyA). Dibanding ikatan 3’-5’ phosphodiester normal, tudung 7-methyl guanosine ditambahkan dan kemudian dimetilasikan pada ujung 5’-P. RNAs yang ter-polydenylasi-kan telah ditemukan dalam beberapa archaea, beranggapan bahwa tudung-tudung modifikasi post-transkripsional mRNA dalam cara ini sama dengan yang muncul dalam sel-sel eukaryotik.

Sebagai hasil dari proses post-transkripsional, molekul-molekul RNA dari mikroorganisme eukaryotik secara umum tidak segaris dengan molekul DNA. Eukayotes dikatakan memiliki ‘split genes’ karena nucleotides, yang mempersempit gen-gen, yang memberi tanda untuk protein tertentu dipisahkan dalam DNA. Rentetan dari landasan nucleotide dalam sebuah mRNA dari sel eukaryotik bukan merupakan pelengkap pada rentetan ‘contiguous linear’ khusus pada kebanyakan sel-sel archaeal dan bakterial. Dalam beberapa kasus, ‘split genes’ telah diidentifikasi juga dalam arcahea seperti dalam gen yang memberi tanda untuk DNA polymerase dalam thermococcus littoralis. Mekanisme dari pemindahan intron kelihatan unik untuk archaea ini.

6-3 SINTESIS PROTEIN: TERJEMAHAN DARI KODE GENETIS

Ekspresi dari aktifitas personal ini dimediasikan secara besar-besaran melaui protein-protein yang berperan sebagai enzim-enzim, mendeterminasi kapasitas metabolik dan, kemudian, phenotipe (penampilan, tingkah laku, metabolisme, dsb). Makromolekul DNA yang menyusun kromosom bakterial dari E.coli secara teoritis mengandung informasi cukup untuk menandakan 3.500 protein-protein yang berbeda: informasi dalam RNA, diperoleh dari DNA selama transkripsi, lalu mengarahkan rentetan asam amino dalam sebuah protein.

Terjemahan dari informasi genetik menjadi molekul-molekul protein, yang bisa melanjutkan informasi genetik secara fungsional, muncul dalam ribosomes. Ribosomes menyediakan ‘framework’ (kerangka kerja) dan dukungan struktural untuk pelurusan proses terjemahan sintesis protein. Pertukaran informasi dari nucleotides ke protein merupakan proses kompleks dan lokasi multiple atas ribosome menjalankan fungsi-fungsi berbeda dalam proses protein-protein ribosomal inji dan ribosomal RNA melanjutkan lokasi fungsional ini (Tabel 6-7). Distorsi dan konfigurasi proper dari ribosome bisa menjaga pertukaran informasi utama dan ekspresi infromasi genetik, membetnuk landasan untuk tindakan berbagai antibiotik.

Semua tiga tipe dari RNA (rRNA, tRNA, dan mRNA) dilibatkan dalam penyampaian informasi dari rentetan nucleotides dalam DNA ke rentetan asam amino dalam rantai polypeptide dari sebuah protein. Molekul-molekul tRNA mengangkut asam amino ke lokasi sintesis protein dan meluruskan asam amino untuk bekerja sama dalam rantai polypeptide. Ini merupakan molekul mRNA, bagaimana pun, yang biasanya mengandung informasi yang ditandai dan menkhususkan rentetan asam amino dalam rantai polypeptide.

Molekul mRNA bakteria biasanya mengandung rentetan nucleotides pada pangkal dan ujung molekul yang tidak menandai asam amino khusus dalam rentetan polypeptide. Melainkan, permulaan, atau ‘leader sequence’ dari nucleotides, dari mRNA dilibatkan dalam inisisi sintesis protein pada ribosomes. Bagian ujung non-terjemahan mendukung pengikatan mRNA ke ribosomes. Penempelan mRNA disempurnakan, mendandakan proksimitas dekat proses transkripsi dan terjemahan.

Penerjemahan muncul dalam tiga fase yang mencolok;
[1] inisiasi proses, selama peptida pertama yang mana dibentuk,
[2] pemanjangan polypeptide baru dengan penambahan rentetan dari asam amino, dan
[3] terminasi dari polypeptide sempurna.

KODE GENETIK

Dengan mRNA, tiga rentetan digunakan untuk menandai asam amino yang diberikan. Oleh karena itu, kode genetika disebut ‘triplet code’ – Tabel 6-9. Setiap rentetan nucleotide triplet dikenal sebagai ‘codon’. Karena terdapat empat nucleotides berbeda, ada 64 codons yang mungkin; bahwa terdapat 64 landasan yang memungkinkan dari empat nucleotides yang berbeda. Kode genetika, yang pada prinsipnya universal, bisa dikatakan memiliki empat huruf alfabet dan 64 kata dalam kamus dengan setiap kata mengandung tiga huruf. Meskipun terdapat enam puluh empat codons yang memungkinkan, protein-protein dalam sistem biologis hanya memiliki 20 ∟– asam amino. Beberpa protein mengandung beberapa asam amino, tapi dalam kasus tersebut asam amino jarang bisanya dibentuk melalui modifikasi enzimatik – post terjemahan dari struktur kimia daripada melalui penandaan rentetan yang mengharuskan asam amino jarang. Dengan demikian ada banyak codons yang dibutuhkan untuk terjemahan informasi genetik, menjadi protein-protein fungsional.

Lebih dari satu codon bisa menandai asam amino yang sama dan oleh karena itu kode genetik dinyatakan ‘degenerate’, menyatakan dengan cara lain, kode genetika berlebih dengan beberpa codons menandai untuk inversi asam amino yang sama, menjadi rantai polypeptide.

Lebih lanjut, ada tiga terminasi codons atau ‘non-sense codons’ dinamakan demikian karena mereka tidak menandai asam amino. Codons terminasi, berperan dan memiliki fungsi yang sangat menandakan terminasi dari sintesis rantai polypeptide.

Kode genetik yang ditunjukkan dalam Tabel 6-9 lebih bersifat universal, dan codons menyusun fungsi dalam sel-sel bakterial, arcaheal dan eukaryotik. Bagaimanapun, beberapa pengecualian telah ditemukan (pada prinsipnya dalam DNA mitokondrial), memaksa sebuah perubahan pada prinsip kode genetik universal. Terminasi codon UGA, sebagai contoh, menandai tryptophan dalam tubuh manusia dan ragi mitokondria dan juga dalam Bagan 6-10. Perubahan-perubahan ini muncul dalam spesies yang menonjol yang terlibat sepanjang periode yang panjang dari waktu dan dihubungkan secara langsung.

Terjemahan informasi dalam molekul mRNA (pembacaan codon-codon) merupakan proses secara langsung. mRNA dibaca dalam arah 5’-P ke 3’-OH, dan polypeptide disintesiskan dari terminal amino ke ujung terminal carbxyl. Molekul mRNA dibaca satu codon (tiga nucleotides) pada suatu waktu. Tidak terdapat ruang antara codon-codon dan mereka tidak bertebrakan. Oleh karena itu, menetapkan sebuah ‘reading frame’ (kerangka membaca) dan dengan demikian menetapkan nucleotide yang mana digunakan untuk menginisiasi pembacaan rentetan tiga-nucleotides, bersifat kritis untuk mengekstraksi informasi utama. Dalam molekul mRNA, ada beberapa rentetan nucleotides yang menjelaskan permulaan dan ujung dari setiap rantai polypeptide yang ditandai.

Di sini kita dapat melihat pentingnya memiliki mekanisme untuk mengenali arah dalam makromolekul informasi. Seperti kita menetapkan konfensi untuk membaca bahasa Inggris dari kiri ke kanan, interpretasi yang benar dari informasi disimpan dalam molekul mRNA membutuhkan pembacaan dari ujung bebas 5’-P ke 3’-OH.

MENGINISIASI TERJEMAHAN mRNA

Pembacaan dari sebuah molekul mRNA mulai dari sebuah titik permulaan yang tepat. Codon pertama yang dibaca adalah AUG, yang memberi tanda asam amino methionine. Dalam sel-sel bakterial, codon AUG memberi tanda methionine (Met) ketika muncul di mana pun dalam molekul mRNA. Pada beberapa bakteria, codon AUG bertindak sebagai inisiator codon yang mengkhususkan f-Met untuk memulai rantai polypeptide, meskipun ketika GUC muncul pada posis internal dalam molekul mRNA, memberi kode untuk valine. Baik itu Met atau f-Met merupakan bagian pertama dari asam amino dalam semua rantai peptide ketika mereka disintesiskan secara inisial, terminal asam amino bisa dimodifikasi secara enzimatis kemudian. Deformylase bisa memindahkan grup formyl dari formylmethionine, dan methionine amino peptidase bisa memindahkan methionine dari amino terminus dari peptide. Oleh karena itu, tidak semua polypeptides dalam mikroorganisme memiliki f-Met pada ujung terminal amino mereka.

Bagian pangkal codon menentukan ‘reading frame’ (rentetan tiga-nucleotide) untuk bagian selebihnya dari molekul mRNA (Fig. 6-37), sebab, landasan-landasan nucleotide dibaca tiga pada satu waktu sepanjang rentai berkelanjutan dari nucleotides, mengubah posisi kerangka membaca dengan memasukan atau menghapus landasan nucleotide tunggal dalam sebuah gen bisa mempengaruhi secara dramatis rentetan asam amino dari protein yang bisa diproduksinya.

Karena terjemahan bisa dimulai secara teoritis dengan berbagai nucleotide melalui triplet codons, terdapat tiga kerangka membaca potensial dalam berbagai kawasan di DNA. Sebuah protein diterjemahkan dengan kerangka yang mulai dengan codon inisiasi AUG, memperluas melalui satu seri codon-codon yang mengkhususkan asam amino, dan berakhir ketika terminasi codon dicapai.

Sebuah kerangka membaca yang mengandung codon-codon yang secara eksklusof mengode asam amino disebut ‘open reading frame’ (ORF). Kerangka membaca yang terkunci tidak bisa dibaca menjadi protein karena kehadiran terminasi codon-codon. Deteksi dari sebuah ORF, yang bisa dilakukan dengan menguji rentetan nucleotide diterjemahkan menjadi sebuah protein. Melacak database dari rentetan nucleotide yang telah ditunjuk untuk memberi kode protein-protein yang dikenali bisa membantu mengidentifikasi fungsi dari kerangka membaca terbuka. Homologies tinggi ditemukan sepanjang spesies-spesies untuk rentetan nucleotides yang telah melibatkan dan mengode protein-protein dengan fungsi-fungsi identik.

Beberapa protein dibutuhkan sebagai faktor-faktor inisiasi untuk memulai proses terjemahan. Dalam sel-sel bakterial, tiga faktor inisiasi, IF1, IF2 dan IF3 dibutuhkan. Sedikit informasi yang diketahui mengenai faktor-faktor inisiasi eukaryotik 4D (eIF4D). Dalam sel-sel eukaryotik, paling tidak sembilan faktor-faktor inisiasi eukaryotik (eIF1 ke eIF6) dibutuhkan untuk memulai sintesis protein.

Meskipun terjemahan muncul dalam rhibosomes 70 S dan 80 S, proses inisiasi membutuhkan ribosomes dibutuhkan menjadi subunit-subunit respektif mereka. Ribosomes biasanya berada dalam titik keseimabangan antara bentuk-bentuk asosiasi dan disasosiasi mereka. Bagian dari peran faktor-faktor inisiasi (IF3 dan eIF6) untuk melindungi pemutusan subunit kecil (30 S atau 40 S) dengan subunit-subunit besar respektif (50 S atau 60 S). Pengikatan IF3 ke subunit ribosomel 30 S cukup penting untuk subunit mengikat mRNA, f-Met tRNA, dan GTP. Dalam sel-sel eukaryotik, sebuah gabungan inisiasi antara elF3, GTP, dan Met-tRNA yang bisa mengikat kepada subunit-subunit 40 S bebas. Gabungan inisiasi ini kemudian bisa mengikat ujung 5’-P dari mRNA dan berpindah ke lokasi inisiasi.

Padahal inisiasi dari sintesis protein mulai dari ujung 5’-P dari molekul mRNA, inisiasi dari sintesis protein dalam sel-sel bakterial mungkin pada lokasi mulai internal dalam mRNA, semenjak kebanyakan bakterial mRNAs merupakan polycistronic.

Dalam sel-sel bakterial, peletakan posisi subunit ribosomal 30 S pada inisiasi yang tepat biasanya bergantung pada rentetan konsensus ribonucleotide dari UCCUCC pada ujung 3’-OH dari 165 rRNA yang ditemukan dalam subunit 30 S. Sekitar tujuh landasan (menuju ujung 5’-P) dari codon mulai AUG dalam mRNA merupakan rentetan konsensus polypurine, AGGAGG, dikenal sebagai rentetan Shine-Dalgarno (Fig. 6-38). Rentetan Shine-Dalgarno muncul dalam sel-sel bakterial dan archaeal tapi tidak ditemukan dalam sel-sel eukaryotik. Rentetan Shine-Dalgarno bersifat pelengkap ke rentetan konsensus dalam 16 S rRNA dan kemudia membentuk kawasan lapisan landasan dari RNA helaian-ganda antara 16 rRNA dan mRNA. Melalui cara ini subunit ribosomal 30 S diorientasikan dengan baik melalui codon insiator, yang memberi sinyal di mana terjemahan mRNA harusnya dimulai. Tidak semua rentetan Shine-Dalgarno mengandung hexamer komplit tapi biasanya empat sampai lima landasan yang bersifat pelengkap terhadap 16 S rRNA.

Setelah inisiasi kompleks telah membentuk dalam sel-sel bakterial, subunit 50 S mengikat ke kompleks 30 S – mRNA – f-Met – tRNA. Ini ditemani oleh hydrolisis dari GTP dan P1 dan melepaskan dan melepaskan dari faktor-faktor inisiasi. Hal yang sama, dalam sel-sel eukaryotik subunit 60 S mengikat kompleks 40 S- ternary, yang melepaskan semua faktor-faktor inisiasi dan hydrolyzes GTP ke GDP.



PERAN DARI TRANSFER RNA DALAM SINTESIS PROTEIN

Sebelum melanjutkan, kita perlu untuk mnyadari peran transfer DNA (tRNA) dalam proses terjemahan. Sebuah molekul tRNA mengandung sekitar 80 nucleotides, sekitar setengahnya melakukan pemasangan landasan. Molekul tRNA membentuk empat lubang, beberapa di antaranya dikarakteristikkan melalui kehadiran nucleotides janggal (Fig. 6-25). tRNA membawa asam amino ke ribosomes dan meluruskan mereka selama terjemahan. Pengikatan asam amino ke molekul tRNA muncul pada ujung 3’-OH dari molekul tRNA. Penyampaian dari asam amino ke molekul tRNA spesifik disebut ‘charging’. Oleh karena itu, molekul tRNA membutuhkan ATP dan sebuah synthetase aminoacyl. Ada paling sedikit satu syntethase aminocyl untuk setiap 20 asam amino. Terdapat paling kurang 20 tipe berbeda molekul tRNA. Setiap 20 asam amino yang muncul dalam protein mengikat ke molekul tRNA. Synthetases archaeal, amynocyl-tRNA muncul dengan menonjol dari kedua rekan imbangan bakterial dan eukaryotik.

Struktur molekul tRNA memiliki peran dalam menetapkan garis utama molekul selama terjemahan. Satu dan empat lubang dimasukkan asam amino; satu mengandung rentetan nucleotides yang berinteraksi dengan tRNA, penetapan orientasi utama ke ribosome; satu berinteraksi dengan synthetase aminocyl; dan satu ,mengandung sebuah wawasan, anticodon, yang berinteraksi dengan mRNA.

Anticodon memiliki tiga nucleotides yang melengkapi ke rentetan nucleotide tiga-landasan dari codon. Bagian ini merupakan pasangan dari codons molekul mRNA dan anticodon dari molekul mRNA yang menjelaskan urutan rentetan asam amino dalam rantai polypeptide. Landasan ke tiga dari anticodon ke codon mRNA lebih signifikan daripada landasan ke tiga dalam rekognisi codon-anti-codon. Fenomena ini dikenal sebagai ‘wobble’ (goyangan), karena goyangan dan degenerasi dari kode genetik, sel tidak harus mensintesis tRNA berbeda untuk setiap 61 codon-codon perasa. Sebagai contoh, hanya dua anticodons tRNA berbeda dibutuhkan untuk mengenali empat codon-codon glycine berbeda.

PEMBENTUKAN POLYPEPTIDE – PEMANJANGAN

Sekembali ke rentetan kejadian sepanjang terjemahan, terdapat dua lokasi dalam ribosome yang terlibat dalam sintesis protein, ‘aminocyl site’ dan ‘peptidyl site’ (Fig. 6-39) Lokasi (area) aminoacyl adalah lokasi di mana molekul-molekul tRNAmembawa asam amino individual secara bagian dipasangkan ke dalam rantai polypeptide. Area peptidyl adalah lokasi di mana rantai peptide yang sedang tumbuh diluruskan. Pada inisiasi sintesis protein, f-Met tRNA atau Met tRNA mengisi lokasi peptidyl di ribosome daripada lokasi aminoacyl, yang normalnya di mana molekul-molekul tRNA terisi berasosiasi dengan ribosome.

Dalam bakteria, penempatan dari molekul tRNA yang terisi, ke dalam lokasi aminoacyl bergantung pada sebuah faktor pemanjangan, EF-Tu. Faktor pemanjangan Tu merupakan protein limpahan dalam sel-sel bakterial, seringkali mencakup 5 % dari total protein-protein seluler. EF-Tu mengkatalis ikatan masing-masing aminoacyl-tRNA ke ribosome. EF-Tu secara inisial membentuk sebuah kompleks dengan GTP, yang kemudian mengisi tRNA untuk membentuk kumpulan dari aminoacyl-tRNA-EF-Tu-GTP. Kumpulan tiga-bagian ini bisa memasuki lokasi aminoacyl dalam ribosome. Kemudian, setelah hydrolisis GTP ke GDP, EF-Tu-GDP dilepaskan. Sebuah faktor pemanjangan, EF-Ts, dibutuhkan untuk mensiklus ulang EF-Tu-GDP kembali ke EF-Tu-GTP. Dalam archaea dan eukaryotes, eEF1α adalah faktor pemanjangan yang bertanggungjawab untuk menjembatani tRNA ke lokasi aminoacyl dalam ribosomes. Reaksi ini juga membutuhkan hydrolisis dari GTP ke GDP.

Ketika molekul-molekul tRNA berpindah ke lokasi aminoacyl, pasangan anticodon utama dengan codon yang sesuai dalam mRNA. Rantai polypeptide kemudian ditransferkan dari tRNA membentuk lokasi peptidyl ke asam amino dipasangkan ke tRNA pada lokasi aminoacyl. Ikatan peptide dibentuk antara grup amino terakhir yang telah ditambahkan ke rantai peptide. Reaksi ini dimeditasikan oleh peptidyl transferase, yang secara dekat diasosiasikan dengan subunit ribosomal 50 S (prokaryote) atau 60 S (eukaryote) dan mungkin inherent dalam rRNA dari subunit yang besar. Energi tidak dibutuhkan untuk membentuk aminoacyl tRNAs. Inisiasi dari sintesis protein, f-Met dalam sel-sel bakterial dan Met dalam sel-sel eukaryotik dipindahkan ke lokasi aminoacyl, membentuk ikatan peptide dengan asam amino kedua dengan molekul mRNA. mRNA kemudian bergerak sepanjang ribosome oleh tiga nucleotides.

Perkembangan mRNA, tRNA dan rantai polypeptide yang sedang tumbuh sepanjang ribosome, proses yang dikenal sebagai ‘translocation’, membutuhkan input energi dari GTP. Hal ini reaksi biokimia janggal yang membutuhkan energi pembawa khusus daripada ATP. Translokasi menggerakkan molekul tRNA dengan sebuah rantai peptide yang dipasangkan ke lokasi peptidyl, meninggalkan lokasi aminoacyl terbuka untuk anticodon dari molekul tRNA berikutnya untuk memasang dengan codon berikutnya dari mRNA. Translokasi membutuhkan sebuah faktor pemanjangan lokal tambahan, EF-G dalam sel-sel bakterial atau eEF-Z dalam sel-sel archaeal dan eukaryotik. Selama terjemahan, molekul tRNA yang telah dipindahkan menuju ke asam amino, dan kemudian tidak lagi diisi, kembali ke cytoplasme, di mana ia bisa disiklus-ulangkan. Di sana, ini bisa diisi kembali lagi dengan sebuah asam amino dan dikembalikan ke lokasi aminoacyl.

TERMINASI DARI SINTESIS PROTEIN

Proses pemanjangan peptide diulang secara terus menerus, menghasilkan pembentukan rantai polypeptide. Pada akhirnya, salah satu terminasi codons muncul pada lokasi amionacyl. Karena tidak ada pasangan-pasangan molekul tRNA diisi dengan codon terminasi, lokasi aminoacyl kosong ketika rantai peptide mencoba untuk masuk ke lokasi tersebut. Dalam bakteria, dua faktor pelepasan, (Rf1 dan Rf2) membantu mengkatalis terminasi formasi ikatan peptide. RF1 berperan dalam UAA atau UAG dan RF2 berperan dalam UGA. Faktor-faktor ini berperan dalam pada lokasi aminoacyl dari ribosome dan berfungsi hanya ketika ada polypeptidyl-RNA di lokasi peptidyl. Dalam sel-sel eukaryotic, ada sebuah faktor pelepasan tunggal, CRF, terlibat dalam terminasi, dan GTP dibutuhkan mengikat faktor ini ke ribosomes eukaryotik. GTP tidak dibutuhkan untuk pengikatan RF1 atau RF2 ke ribosomes sel bakterial. Di terminasi, ujung carboxyl dari peptide sedang disintesiskan, ditransfer ke H2O. Tindakan ini menyebabkan rantai polypeptide dilepaskan ke cytoplasma di mana ini bisa menumpuk ke protein dengan bantuan dari molekuler chaperons ke struktur utama, ke dua, tertier, dan kadang-kadang kuarter, dan di mana sebagai sebuah protein ini bisa memainkan peran fungsional dalam mediasi metabolisme dan struktur dari organisme.

MODIFIKASI POST-TERJEMAHAN DARI PROTEIN

Rantai-rantai polypeptide yang tersintesis terbaru melanjutkan perubahan enzimatis tambahan yang memodifikasi protein setelah terjemahan terlengkapi. Perubahan-perubahan ini serungkali mempengaruhi pengikatan polypeptiden untuk mengubahnya secara biologis dalam bentuk aktif. Reaksi-reaksi ini dikelompokkan sebagai modifikasi post-terjemahan.

Semua protein-protein yang tersintesis mulai dengan ‘formylmethionine’. Semua protein-protein archaeal dan eukaryotik yang tersintesis terbaru mulai dengan methionine. Dalam bakteria, grup formyl biasanya dipindahkan oleh deformylase meninggalkan methionine sebagai asam amino pertama dalam polypeptide. Methionine ini atau methionine dalam protein-protein archaeal dan eukaryotik sering dipindahkan oleh methionine amino peptidase meninggalkan asam amino lainnya pada amino ferminus. Beberapa sel-sel bahkan memindahkan asam amino terminal carboxy dari protein-protein. Dalam sel-sel eukaryotik, terminal amino asam amino sering di-acetylasi-kan.

Beberapa asam amino bekerja sama dengan menjadi polypeptide yang sedang berkembang yang kemungkinan juga dimodifikasi secara individual. Serine, tyrosine, atau sisa-sisa threonine mungkin di-phosphorylasi-kan oleh kinase-kinase protein TP-mandiri. Grup-grup ekstra carboxyl mungkin ditambahkan kepada asparte dan juga ke hydroxyproline.

Berbagai protein-protein diikatkan menjadi struktur-struktur tertier dan kuarter dengan pembentukan inter-rantai covalent atau inter-rantai ikatan disulfide. Jembatan-jembatan disulfide ini muncul antara sisa-sisa cysteine khusus. Mereka dibentuk secara enzimatis dengan oksidasi dua kelompok sulfhydryl. Pengikatan protein mungkin juga bergantung dengan aktifitas protein-protein tertentu, disebut chaperones yang membantu proses ini.

Salah satu perbedaan utama antara protein-protein bakteria dan eukaryotes adalah penambahan dari rantai-rantai sisi carbohydrate (glycosylation) ke sisa-sisa khusus dari rantai polypeptide baru. Hanya beberapa protein dari bakteria telah ditunjuk untuk di-glycoslacy-kan secara post-terjemahan. Sel-sel eukaryotik sering memiliki carbohydrat tambahan ke sisa-sisa asparagine (N-linked oligosaccharides) atau ke serine, threonine, atau sisa-sisa hydroxyline (N-linked oligosaccharides). Mikroorganisme eukaryotik mendekati kondisi memiliki glycosylation sederhana, secara frequent dengan gula-gula mannose. Semakin tinggi organisme-organisme eukaryotik menambah cabang-cabang oligosaccharides yang terdiri atas berbagai macam gula.

Mekanisme yang lainnya dari modifikasi protein ditemukan dalam mikroorganisme adalah penyatuan rentetan asam amino di luar protein setelah mereka dibentuk. Analogous untuk penyatuan intron-intron RNA selama transkripsi, penyatuan protein melibatkan perpindahan ‘intens’ (intron protein), meninggalkan ‘exteins’ (exon-exon protein) dalam protein yang diproseskan. Protein-protein yang mengandung intein-intein telah ditemukan dalam sel-sel bakterial, archaeal, dan eukaryotik. Bukti menunjukkan bahwa intein-intein mungkin dipindahkan dari protein-protein oleh sebuah proses autokatalis yang melibatkan sisa asparagine terjalin pada ujung intein.

Rentetan berselang yang menandai endonucleases telah diidejntifikasi melalui beberapa DNA polymerases archaeal. Dalam archaeans Thermococcus littoralis dan sebuah Pyrococcus produk terjemahan utama diproses untuk menghasilkan protein internal (intein) dan protein dewasa aktif dibentuk dengan menggabungkan rentetan eksternal (ekstein). Dua inteins ditemukan dalam DNA polymerase dari T.littoralis dan satu intein dalam spesies Pyrococcus. Protein yang sama, dengan kejadian pengikatan yang sama, seperti dalam pembentukan ATPase dewasa dari Saccharomyces cereviceae dan Cadida tropicalis, dan dalam sel-sel bakterial, seperti RecA protein dari Microbacterium tubercolosis dan M.leprae. Dalam sistem-sistem ini, inteins memiliki tingkat yang tinggi atas rentetan nucleotide, berhomologo terhadap pengotakan endonucleoses dan beberapa telah didemonstrasikan untuk memiliki aktifitas endonuclease. Sementara memproses pemindahan inteins secara jelas muncul dalam beberapa kasus untuk membentuk protein-protein dewasa, berbagai protein tidak termasuk inteins. Sebagai contoh, meskipun DNA polymerases dari beberapa Thermococcus dan spesies Pyrococcus memiliki inteins, archaean yang lainnya seperti Methanococcus voltae, Pyrococcus furiosus, dan Sulfalobus solfatoricus kurang akan inteins. Hal yang menarik adalah DAN polymerase archaeal dewasa dari archaeans dengan intens dan bagi yang kurang memiliki intens, memiliki jumlah yang sama atas asam amino (774-775 asam amino). Mereka juga melewati rentetan asam amino yang terkonserfasi, yang muncul mewakili kawasan fungsional dari DNA polymerase.

6-4 REGULASI EKSPRESI GEN BAKTERIAL

Sebagai tambahan dalam penandaan informasi untuk rentetan polypeptide spesifik dari protein-protein, genome dari sel menandai informasi yang meregulasi ekspresinya sendiri. Genome dibagi atas beberapa rentetan DNA, yang dikenal ‘genes’, yang memiliki fungsi-fungsi spesifik. Beberapa genes menandai untuk sintesis RNA dan protein; menentukan, secara benar rentetan dari landasan-landasan subunit ribonucleotide dan asam amino dalam makromolkeul di atas. Gen-gen yang menandai protein dikenal sebagai gen-gen struktural, atau cistrans. Gen-gen lainnya memiliki fungsi sebagai regulator, mengisi dan mengatur genotype dan menentukan phenotype, yaitu, penampilan aktual dan aktifitas dari sebuah organisme.

Dengan mengontrol gen yang mana dari organisme dikonversikan menjadi enzim-enzim fungsional, sel meregulasi aktifitas metaboliknya. Beberapa bagian dari DNA secara spesifik dilibatkan dalam transkripsi regulasi, dan gen-gen regulator ini bisa mengontrol sintesis dari enzim-enzim khusus. Dalam beberapa kasus, ekspresi gen tidak ditujukan ke kontrol regulator genetik khusus, dan enzim-enzim dikode untuk kawasan-kawasan seperti di atas, dari DNA, lebih bersifat ‘constitutive’, bahwa, mereka disintesiskan secara berkelanjutan,

Beberapa enzim disintesiskan hanya ketika sel membutuhkan mereka. Enzim-enzim seperti di atas disebut ‘inducible’ (dibuat hanya berdasarkan respon terhadap substansi inducer tertentu), atau ‘repressible’ (dibuat paling tidak melalui kehadiran represi khusus subtansi), seringkali, beberapa enzim yang memiliki fungsi-fungsi berkaitan dikontrol melalui gen-gen regulator yang sama.

Kontrol terhadap ekspresi gen-gen struktural untuk aktifitas metabolik terkoordinasi dalam sel-sel bakterial dijelaskan dalam bentuk bagian dengan ‘model operon’ yang mendemonstrasikan bahwa bagaimana transkripsi mRNA melangsungkan sintesis dari enzim-enzim ini, diregulasikan. Sebuah ‘operon’ adalah sebuah rentetan DNA yang menandai untuk satu atau lebih polypeptides (gen-gen struktural), biasanya untuk fungsi yang berkaitan, dan sebuah rentetan DNA yang meregulasi ekspresi gen-gen di atas.

Induksi dan represi didasarkan atas gen-gen regulasi membentuk protein regulator yang mengontrol transkripsi dengan mengikat ke lokasi khusus dalam DNA (Fig..6-40). Regulasi dari transkripsi mungkin di bawah kontrol negatif, di mana untuk sebuah set tertentu dari gen-gen disintesiskan daripada ini ditutupkan melalui protein regulasi. Di sisi lain, regulasi transkripsional dari set berbeda gen-gen mungkin di bawah kontrol negatif, di mana mRNA disintesiskan hanya dalam kehadiran protein regulatory yang mengikat DNA.

Gen-gen archaeal dengan fungsi terkoordinasi dikelompokkan sebagaimana saat berada dalam sel-sel bakterial. Ada perbedaan-perbedaan dari bakterial operons, bagaimanapun, dalam pengelompokan tersebut dalam kromosom archaeal mengandung promoters internal dan terminators. Promoters dalam sel-sel bakterial merupakan bagian dari kawasan operator dan tidak dalam operon. Juga transkrip yang diproduksi dari operon dalam sel bakterial adalah panjangnya dan selalu menandai pelengkap penuh protein dan dari operon. Transkrip dari archaeal operons berbeda-beda panjangnya dan hanya menandai beberapa protein dalam operon.

MEREGULASI METABOLISME LAKTOSA: LAC OPERON

Salah satu kajian (penelitian) terbaik sistem fokus kepada sistem regulatory enzim-enzim yang diproduksi oleh Escherichia coli K-12 untuk metabolisme laktose (Fig. 6-41). Tiga enzim-enzim secara khusus disintesiskan oleh E.coli untuk metabolisme laktosa; β-galaktosidae, galakstosidae permease, dan thiogalactoside transacetylase. β-galaktosidae membelah dissaccharida lactose menjadi monosaccaharides galactose dan glucose. Permease dibutuhkan untuk pengangkutan aktif laktosa melalui membran cytoplasmic bakterial, dan transacetylase meng-acetylasi-kan galaktosides, membiarkan mereka lepas dari sel sehingga mereka tidak mengakumulasi ke tingkat toxic. Gen-gen struktural yang menandai produksi dari tiga enzim-enzim ini muncul dalam bagian contiguous DNA, yang mengode ke polycistronic DNA. Meskipun terdapat beberapa tingkat basal dan ekspresi gen dalam kehadiran sebuah ‘inducer’, gen-gen struktural ini ditranskripsikan dengan baik hanya dalam kehadiran sebuah ‘inducer’.

Operon untuk metabolisme laktose, lac operon, meliputi:
(1) Kawasan promoter (P) di mana RNA polymerase mengikat.
(2) Gen regulatory ( I ) yang menandai sintesis protein repressor, dan
(3) Sebuah kawasan operator ( O ) yang muncul antara promoter dan tiga struktural gen-gen yang terlibat dalam metabolisme laktosa.
Gen regulatory mengode untuk protein repressor, yang berada pada kehadiran lactose mengikat ke kawasan operator dari DNA. Pengikatan dari protein repressor pada kawasan operator mengunci transkripsi gen-gen struktural di bawah kontrol kawasan operator tersebut. Pada beberapa operon, kawasan operator rentetan nucleotide dan kawasan promoter rentetan nucleotide bertentangan atau bertabrakan satu sama lainnya. Operon-operon lainnya mungkin memiliki lebih dari satu, atau banyak, promoters.

Dalam kasus ‘lac’ protein, tiga gen ‘lac’ struktural yang mengode untuk tiga enzim-enzim dilibatkan dalam metabolisme lactose tidak ditranskribkan dalam ketidakhadiran lactose. Kawasan operator dari ‘lac’ operon berdampingan atau berlawanan dengan kawasan promoter. Pengikatan protein represor di kawasan operator intereferensi dengan pengikatan RNA polymerase di kawasan promoter. ‘Inducer’ dari ‘lac’ operon, allolactose (derifatif dari lactose), mengikat ke protein represor dan mempengaruhi penyesuaian protein represor. Ini bertindak sebagai sebuah effector allosteric, dan oleh karena itu hal ini berfungsi untuk interaksi dengan dan mengikat di kawasan operator. Kemudian dalam kehadiran sebuah ‘inducer’ yang mengikat dengan protein represor, transkripsi dari ‘lac’ operon didepresikan, dan sintesis dari tiga protein struktural diperlukan untuk proses metabilisme laktosa.

Sebagaimana laktosa dimetaboliskan dan konsentrasinya mengurang, konsentrasi dari allolactose derifatif, dioroduksi dari laktosa dengan tingkat rendah dari β-galactosidae, juga menolak, menjadikannya cocok untuk mengikat dengan protein represor. Kemudian molekul-molekul protein represor aktif juga cocok untuk mengikat di kawasan operator dan transkripsi ‘lac’ operon direpresikan, menghentikan produksi selanjutnya dari enzim-enzim yang terlibat dalam metabolisme laktose yang dikontrol dengan kawasan regulatory ini dari DNA. Di bawah kindisi normal (ketidakhadiran lactose), ‘lac’ operon direpresikan dan transkripsi dari gen-gen pengguna laktose tidak muncul. Hanya dalam kemunculan ‘inducer’ – ‘lac operon’ didepresikan sehingga transkripsi dari gen-gen pengguna laktose muncul. ‘Lac’ operon adalah bagian tipe khusus operon-operon yang ter-induce dan terkontrol secara negatif yang meregulasi jalan atau alur catabolic, di mana kehadiran dari inducer yang sempurna, sistem direpresikan.
Penelitian terbaru terhadap struktur repressor operon lactose dan kekompleksitasannya dengan DNA dan inducer telah meningkatkan pemahaman bagaimana ‘lac’ operons berfungsi. Hal ini kemudian diketahui bahwa ‘lac’ operon memiliki tiga lokasi pengenalan repressor ‘lac’ dalam 500 base pair (bp) kawasan dari DNA. Dalam ketidakhadiran lactose, protein repressor fungsional, yang merupakan tetramer dengan kuat ke kawasan-kawasan DNA dan mengunci transkripsi. Setiap subunit monomeric memiliki sebuah kawasan terminal amino yang secara spesifik mengikat diri ke DNA, kawasan hinge, inti pengikatan gula, dan carboxyl-terminal helix. Area pengikatan DNA dari ‘lac’ repressor mengandung motif helix-turn-helix yang sama dengan protein-protein regulator lainnya. Protein tetrameric ‘lac’ repressor memiliki 360 asam amino dan berat molekular sebanyak 154,520 daltons. Protease pencernaan dari tetramer memproduksi inti carboxyl-terminal tunggal yang mengikat inducer empat fragment terminal amino, masing-masingnya bisa mengikat ke operator DNA. Pengendalian ‘lac’ operon bersifat kompleks. Ada tiga kawasan operator dalam ‘lac’ operon yang disusun yaitu O1, O2, dan O3. Operator prinsipal adalah O1, O2 ditempatkan di 401 bp jauh di bawah dari O1 : O3 ditempatkan 93 bp jauh di atas dari O1. Ketiga operator dibutuhkan untuk ekspresi gen maksimal. Pengikatan repressor ke operator mengerutkan konformasi DNA sehingga bisa jauh membelokkan dari repressor. Hal ini mempengaruhi alur DNA helix ganda dan bertanggungjawab untuk perubahan dalam efisiensi transkripsi. Tambahan lagi, aktifasi ‘lac’ operon melibatkan protein aktifator AMP-dependent siklus yang kehadiran dari konsentrasi tinggi atas AMP siklus meningkatkan transkripsi dengan peningkatan kepada lokasi yang dikenali dalam dampingan DNA ke lokasi dari penggabungan DNA polymerase. Struktur dari tetrametris repressor menegaskan bahwa berperan dengan protein aktifator gen katabolis dan membentuk jalur represi di mana di dalamnya tetrametrik represor beriteraksi secara simultan dengan dua jalur DNA (Fig, 6-42).




REPRESI CATABOLITE

Ketika E.coli tumbuh dalam sebuah medium yang mengadung glukose dan laktose. Hal ini tidak menggunakan gula secara simultan atau berkelanjutan. Melainkan menggunakan glukose pertama sampai gula tersebut dikurangi dan kemudian berubah ke penggunaan laktose sebagai sumber karbon. Hasil-hasil ini dalam sebuah biphasic (dua fase) pola pertumbuhan yang dikenal sebagai ‘diauxie’ atau ‘pertumbuhan diauxic’ (Fig. 6-43).

Pada fase pertama pertumbuhan glukose, gen-gen yang memadai enzim-enzim yang mengeluarkan laktosa dimatikan. Setelah mengurangi glukosa, ada fase lanjutan dalam pertumbuhan selama gen-gen yang mana, yang menandai enzim-enzim yang mengeluarkan laktose dihidupkan dan di-transkrip-kan, lalu diterjemahkan menjadi protein-protein. Kemudian, sel-sel bisa me-resume pertumbuhan optimal menggunakan laktose (laktosa). Mekanisme yang membiarkan bakteria untuk mendiskriminasi antara penggunaan sumber karbon yang berbeda. Pada umumnya karena represi catabolite.

Represi catabolite adalah tipe yang digenerelasikan dalam represi yang secara simultan mematikan beberapa operon (Fig.6-44). Pada kehadiran konsentrasi glukosa yang tepat, sebagai contoh, beberapa alur katabolis (catabolite) direprewsikan olek represi catabolite, termasuk yang termasuk dalam metabolisme laktose dan arabinose. Ketika glukosa sesuai untuk katobolisme dalam alur glycolytic, monosaccharides dan dissaccharides lainnya tidak diperlukan oleh sel untuk mengenerasikan ATP, dan dengan penutupan metabolisme darikarbohidrat-karbohidrat yang lainnya. Sel mendukung sumber-sumber metabolisnya.

Represi metabolisme adalah sebuah contoh dari regulasi dengan kotrol positif. Ini bertindak melalui kawasan promoter DNA, dan dengan melakukannya hal ini melengkapkan kontrol yang dipaksakan oleh kawasan operator. Pengikatan efisien RNA polymerase ke kawasan promoter terhadap represi catabolite membutuhkan kejadiran protein aktifator catabolite (catabolite actifator protein – CAP). Dalam ketidakhadiran CAP, RNA polymerase memiliki efinitas yang diturunkan paling besar untuk mengikat kawasan promoter. CAP, pada gilirannya, tidak bisa mengikat ke kawasan promoter kecuali diikat ke (cAMP-cylic adenosine monophosphate).

Ada hubungan yang samar antara konsentrasi cAMP dan ATP, di mana tingkat CAP rrespon ke keadaan metabolisme seluler. Molekul-molekul cAMP dibentuk dari ATP melalui enzim adenyl cyclase (Fig. 6-45). Tingkat intra seluler dari CAP yaitu rendah ketika substrat 24 yang bisa dinetrabolismekan dengan tepat digunakan. Di bawah kondisi ini, CAP tidak bisa mengikat pada kawasan promoter. Akibatnya, RNA polymerases tidak bisa mengikat ke promoters catabolite dan transkripsi pada sejumlah gen-gen struktural yang diregulasi menimbulkan dalam sebuah sikap terkoordinasi. Dalam ketidakadiran glukose, terhadap pemasukan sesuai dari cAMP untuk membiarkan pengikatan RNA polymerase ke kawasan promoter. Lalu, ketika tingkat glukose rendah, cAMP menstimulasi inisiasi sebagai enzim-enzim yang diiduksikan.

Aktifitas adenyl cyclase, yang terdapat pada konsentrasi intra seluler cAMP per bagiannya diregulasikan melalui sistem:
Phosphoenolpyruvate; phosphotransferase (PEP ; PTS) – bagian 3 (BAB III). Enzim IIIglc dari PEP; PTS berfungsi untuk melempar kelompok phophate dari HPr ter-phosphorylasi ke Enzim IIglc. Oleh karena itu, Enzim IIIglc bisa bergerak dalam dua bentuk yang berbeda, apakah phosphorilated (EIIIglc-p) atau non-phosphorylated (EIIIglc). Ketika glukose ditampilkan di luar sel, Enzime IIIglc memindahkan secara bertahap grup phosphate ke enzim IIglc dan kemudian ke glukose sebagai gula, ditransportasikan melalui membran cytoplasmic. Oleh karena itu, ketika glukose ditampilkan, bentuk EIIIglc mendominasi.

EIIIglc (bukan EIIIglc-p) merupkaan sebuah inhibitor alloperic dari adenyl cyclose. Hal ini maksudnya ketika glokse ditampilakan, dan EIIIglc memiliki tingkat yang tinggi aktifitas adenyl cyclase dihalangi dan tingkat cAMP diturunkan. Ketika glukose hilang dan lactose muncul, EIIIglc~P memiliki tingkat yang tinggi, aktifitas adenyl cyclase tidak dihalangi, dan tingkat cAMP meningkat. Konsentrasi yang sesuai dari cAMP membiarkan sel untuk traskrip pada operon represible catabolite-nya, seperti ‘lac’ operon.

MEREGULASI BIOSINTESIS DARI TRYPTOPHAN; ‘TRP’ OPERON

Gen-gen regulatory bisa dimatikan di bawah kondisi-kondisi khusus. Seperti ‘repressible operon’ mengontrol alur biosintesis khusus. Sebagai contoh, ‘trp’ operon, yang mengandung gen-gen menandai enzim-enzim dibutuhkan untuk biosintesis asam amino tryptophan, mudah direpresikan (Fig. 6-46). Ada lima gen-gen struktural dalam ‘trp’ operon yang bertanggungjawab untuk sintesis lime enzim. Sebagaimana dengan operon 24 lainnya, ada juga kawasan opratot, kawasan promoter, dan gen-gen yang menandai untuk protein-protein regulator dalam ‘trp’ operon. Protein represor ‘trp’ operon normalnya tidak aktif dan ytidak bisa mengikat pada kawasan operator. Tapi, tryptophan bisa berperan sebagai ‘allosteric effector’ atau corepresor’. Dalam kehadiran dari ‘excess tryptohpan’, protein represor itu mengikat dengan tryptophan dan sebagai hasilnya, kemudian mampu untuk mengikat ke kawasan operator ‘trp’, ketika protein represor ‘trp’ tryptophan complex’ mengikat pada kawasan operator ‘trp’, transkripsi dari tryptophan direpresikan.

Dalam hal kontrol negatif oleh operon ‘trp’ tryptophan berean sebagai substansi represor yang mematikan alur biosintesis untuk sintesisnya sendiri ketika ada pemasukan yang sesuai dari tryptophan. Ini adalah cotoh dari represi produk akhir – proses mematikan transkripsi dengan produk-by dari metabolisme yang ditandai melalui gen yang ada di operon. Ketika tingkat tryptophan dalam sel menurun, terdapat tryptophan yang sesuai untuk berperan sebagai corepresor, dan traksripsi dari ‘gen-gen untuk biosintesis tryptophan menjadi dipersingkat. Operon ‘trp’ adalah bagian yang serupa dari alur anabolyc, di mana dalam kehadiran permintaan yang sesaui dari produk biosintesis, sistem direpresikan.


REGULASI DARI TRANSKRIPSI TERJEMAHAN: ATTENUASI

Atenuasi merupakan sebuah mode atau proses regulasi ekspresi gen di mana kejadiannya muncul selama terjemahan mempengaruhi tranksripsi dari sebuah operon kawasan DNA (Fig.6-47). Seperti yang diindikasikan sebelumnya, terkemahan dalam bakteria dan archaea pada dasarnya mulai sebelum ditranskripsi mRNA dilengkapi, sebagai porsi utama mRNA dirangkapkan ke metabolisme dan diterjemahkan mulai sebelum mRNA lengkap ditranskripsikan. Rentetan utama dalam sel-sel bakteria muncul antara operator dan gen-gen struktural pertama. Dalam hal operon ‘trp’ terdapat sebuah lokasi atenuator antara operator dan gen-gen struktural pertama dari operon (atau dekat dari rentetan utama) di mana transkripsi bisa diinterupsikan.

Apakah terminasi muncul atau tidak ditentukan oleh struktur kedua dari mRNA di kawasan atenuator. Terdapat dua struktur yang memungkinkan dari mRNA. Pada satu bentuk, mRNA menjalin untuk menetapkan kawasan helaian-ganda, yang dikenal sebagai ‘terminator hairpin’, yang menyebabkan terminasi transkripsi. Struktur tertentu yang membentuk bergantung kepada ketersediaan tryptophan karena tryptophan adalah salah satu asam amino ditandai untuk kawasan utama (pangkal). Ketika tryptophan terdeia untuk penyatuan dengan protein-protein, rentetan peptide yang ditandai oleh rentetan utama ini bisa diterjemahkan dengan sempurna. Saat tryptophan mencapai konsentrasi paling rendah, bagaimanapun, terjemahan ditunda pada codon utama yang ditandai untuk insersi tryptophan ke polypeptide. Ini adalah tryptophan yang sesuai dan diisi tryptophil – tRNA tidak tersedia. Ketika proses terjemahan diperlambat, mRNA berada pada bentuk yang melanjutkan transkripsi untuk memproses melalui keseluruhan rentetan dari operon ‘trp’, bagaimanapun, jika ada tryptophan yang sesuai dari operon ‘trp’ berhenti, sehingga tidak ada dari gen-gen struktural untuk metabolisme ditranskripsikan.



Sebagai tambahan ke operon tryptophan, operons histidine dan penylalanine dalam E.coli juga mengandung kawasan attenuator. Dalam histidine, terdapat rentetan 7-contiguous codons pada rentetan pangkal. Dalam penylalanine ada lime belas. Hanya ketika konsentrasi dalam asam amino sangat rendah dalam melakukan terjemahan, melanjutkan transkripsi ke proses selanjutnya melalui lokasi atenuator. Atenuator melengkapi regulasi dari ekspresi gen melalui gen operator. Kemudian terdapat pengurangan dalam mekanisme. Mekanisme kontrol untuk biosintesis dari asam amino seperti tryptophan. Rentetan utama dan lokasi atenuator yang diasosiasikan menjadi sebuah mekanisme untuk menjadi lebih baik atas kontrol dan transkripsi dan ekrepresi informasi genetis dari kawasan operator.

DUA KOMPONEN SISTEM REGULATORY

Berbagai bakteria memiliki sistem regulatory yang membiarkan mereka untuk menjalin ekspresi gen-gen tertentu ke sinyal-sinyal kimia dalam lingkungan mereka. Sistem ini memiliki dua komponen, satu yang merasakan stimulus kimia dan ke dua, yang melanjutkan sinyal, melanjutkan tingkat transkripsi (Fig. 6-48). Komponen sensory utama dari sistem regulatory dua-komponen melibatkan histidine kinases berbeda yang kadang-kadang disebut ‘sensor kinases’. Histidine kinases memiliki rentetan sekitar 200 asam amino pada ujung carboxy terminal. Histidine kinase menjadi ter-phosphorilasi pada sisa histidine dalam kawasan terminal terkonserfasi ini. Proses phosphorylasi yang dipacu oleh reaksi dengan sebuah kimia lingkungan, secara aktual dikataliskan oleh histidine kinase sehingga proses merupakan salah satu bagian dari ‘autophosphorylasi’. Phosphate diambil ATP dalam energi ini membutuhkan reaksi:
Histidine kinase (HK) + ATP →
Phosphorylated histidine kinase (HK-P) + ADP

Komponen ke dua dari sistem regulatory adalah regular response yang di-phosphorylasi-kan oleh histidine kinase.
HK-P + Regular response →
HK + Phosphorylated regular response
Ujung terminal amino dari regulator-regulator respon mengandung rentetan yang dikonserfasi sekitar 100 asam amino. Phophorylasi muncul pada asam amino (aspartate) dalam kawasan terkonserfasi ini. Ketika regulator respon diaktifkan dengan penambahan phosphate, ini berprean apakah sebagai inducer atau represor transkripsi. Bentuk ter-phophorylasi dari regulator respon khusus mengikat ke faktor-faktor sigma dan menghidupkan atau mematikan ekpresi gen-gen dari operon terebut.

REGULASI DARI EKSPRESI GEN EUKARYOTIK

Regulasi dari ekspresi dalam mikroorganisme eukaryotik lebih kompleks daripada bakteria, dan berbagai mekanisme dijelaskan mungkin tidak beroperasi dalam perlakuan yang sama pada bakterial, archaeal, dan sel-sel eukaryotik. Beberapa enzim dalam mikroorganisme eukaryotik bisa di-induce-kan dengan mudah dan yang lainnya mudah direpresikan, tapi ekspresi dari enzim ini mungkin tidak bekerja di bawah kendali dari mekanisme yang mudah diperbandingkan ke ‘lac’ operon dalam E.coli.

Setiap mRNA dari sel-sel eukaryotik secara umum mengandung informasi hanya untuk satu protein dan inti ini bersifat monocistronic daripada polycistronic. Dengan demikian kontrol keseluruhan molekul-molekul mRNA berbeda mungkin dibutuhkan untuk meningkatkan kendali terkoordinasi dalam eikaryotes, di mana kontrol atas molekul mRNA tunggal, membawa informasi untuk ekspresi beberapa gen-gen contiguous dan berkelanjutan dalam sel bakterial, bisa meregulasi sintesis dari beberapa enzim dengan fungsi yang berkaitan. Tambahan lain, dalam berbagai kasus, rentetan dari codon-codon atas gen yang diberikan dalam mikroorganisme eukaryootik tidak bersejajaran dengan molekul mRNA atau dengan rentetan polypeptide protein. Hal ini kemudian tidak biasanya dalam mikroorganisme eukaryotik, sebuah kawasan operator bisa meregulasi transkripsi dari serangkaian gen yang bersifat ‘contiguos’ dengan kawasan gen regulator. Hal ini secara efektif meningkatkan eksistensi dari kawasan operon seperti muncul dalam sel-sel bakterial, meskipun tipe analogous dari kontrol operon melalui cabang gen bisa lebih eksis dalam sel-sel eukaryotik.

Serangkaian mekanisme kontrol mungkin berbeda dalam mikroorganisme eukaryotik untuk mengontrol ekspresi genetik. Hal ini meliputi hilangnya gen-gen, ampligikasi gen-gen, perubahan gen, transkripsi berbeda dari gen-gen, modifikasi post-terjemahan RNA, dan kontrol terjemahan.

Beberapa sel-sel dari organisme juga kehilangan gen-gen. Sebagai coontoh, pada Protozoan Oxytricha, eliminasi dari kebanyakan DNA (hilangnya gen) muncul dalam sel-sel vegetatif. Mekanisme ini melanjutkan spesialisasi dalams sel-sel vegetatif di mana analogous terhadap pembedaan sel-sel somantik dalam organisme paling tinggi. Kebanyakan organisme eukaryotik tertinggi tidak menggunakan eliminasi gen, meskipun beberapa serangga menggunakannya sebagai alat pembeda.

Kebanyakan sel-sel eukaryotik mampu untuk ‘meningkatkan ekspresi gen’, dengan itu memproduksi sejumlah besar enzim yang ditandai untuk gen yang diberikan. Eukaryotes melakukan demikian dengan meningkatkan jumlah rRNA, lalu meningkatkan sejumlah ribosomes yang bisa digunakan untuk menerjemahkan molekul mRNA stabil. Ribosomes bergabung pada mRNA yang sama sehingga hasil terjemahan dalam salinan banyak dari protein tersintesis. Dalam protozoan (kelas protozoan). Tetrahymena, sebagai contoh, terdapat ratusan salinan dari gen-gen untuk rRNA dalam sel vegetatif yang menyediakan mekanisme untuk amplikasi gen.

Dalam genome eukaryotik, posisi dari beberapa dari beberapa gen-gen ditukar, kemudian mengatur lokasi gen-gen dalam kromosom eukaryotik. ‘Pengaturan ulang gen-gen’ (perubahan dalam posisi relatif dalam kromosom) bisa mempengaruhi ekspresi informasi yang dikandung dalam tipe pasangan terpengaruh dalam ragi dan produksi dari protein-protein permukaan dalam protozoa. Fenomena ini juga telah diobservasi dalam bakteria, sebagai contoh dalam kasus sintesis protein flagellin dalam Salmonella.

Bagian tambahan dari mekanisme ini, kawasan promoter dalam organisme eukaryotik dalam pengikatan RNA polymerase dan mungkin ini merelokasikan regulasi genetik dari tipe yang dilakukan dalam represi catabolite oleh bakteria. Berbagai promoter eukaryotik mengandung rentetan penguat yang melibatkan interaksi dengan protein pengikat DNA khusus agar transkripsi terjadi. Tipe ini berada pada kontrol positif (mekanisme) umum ditemukan dalam sel-sel eukaryotik.

Hal ini juga berkemungkinan bahwa modifikasi post-terjemahan hnRNA dilibatkan dalam kendali ekpresi genetik dalam eukaryotes. Rentetan utama, intron-intron, dan rentetan trailer molekul RNA dalam mikroorganisme eukaryotik. Regangan yang berbeda atas Tetrahymena memiliki intron-intron berbeda dalam gen-gen yang menandai untuk rRNA mereka. Selanjutnya, regulasi terjemahan mungkin lebih penting dalam mengontrol ekspresi gen dalam eukaryotes daripada dalam bakteria karena perpanjangn relatif mRNA dalam sel-sel eukaryotik.

Penelitian akhir-akhir ini telah mulai memecahkan kerumitan kejadian tingkat-molekular yang mengendalikan ekspresi gen dalam sel-sel eukaryotik. Beberapa protein disebut ‘architectural protein’, mengikat ke DNA dalam sel-sel bakterial dan eukaryotik, menyebabkan DNA mengikat secara keseluruhan, 70˚ ke 120˚. Protein-protein arsitektural muncul mengikat alur minor dari pasangan landasan DNA akan menjauh. Sekali mereka dibawa secara bersama-sama, kerumitan protein-DNA ini mengaktifkan transkripsi. Satu protein yang mengikat ke kotak TATA untuk mengaktifkan transkripsi menginisiasi pembentukan dari kumpulan kudaa-kuda sekitar 50 protein yang mengikat DNA. Faktor transkripsi diperlukan untuk transkripsi sesuai ke ikatan dalam DNA, melanjutkan pemanfaatan RNA polymerase. Dalam beberapa kasus, ikatan DNA mengaktifkan transkripsi meskipun pembentukan kumpulan protein kuda-kuda bisa jadi ribuan pasangan landasan dari lokasi di mana RNA polymerase mulai.

Mekanisme yang lain dari pengaktifan ekpresi gen yang melibatkan pengacauan struktur nucleosome telah ditemukan akhir-akhir ini. Beberapa reaksi membutuhkan ATP dari DNA dengan protein-protein pengikat DNA dalam nucleus mengacaukan histones. Berbagai protein besar muncul berkemampuan pengacauan histone. Pengacauan struktur nucleosome yang menghancurkan gen-gen yang di-transkrib-kan. Pengaktifan transkripsi dengan pengacauan histone seakan-akan menjauhi mekanisme regulatory dari pengikatan DNA dan faktor transkripsional yang mengontrol ekspresi gen. Ini merupakan mekanisme satu lagi yang meregulasi dan ekspresi gen dalam sel-sel eukaryotik.

Hal ini kemudian jelas bahwa ada beberapa mekanisme untuk meregulasi ekspresi gen dalam mikroorganisme eukaryotik yang tidak eksis dalam bakteria. Penguraian kekompleksitasan dari regulasi gen dalam eukaryotes dan mengembangkan pemahaman yang lebih baik dari regulasi genetik dalam bakteria menyisakan tantangan utama untuk para ahli genetika mikrobial.